Mess-Zellzyklus-Progression Kinetics mit Metabolische Markierung und Durchflusszytometrie
Summary
Tracking-feine Veränderungen in der Progression und die Kinetik der Zellzyklusstadien kann durch Verwendung einer Kombination von metabolische Markierung von Nukleinsäuren mit BrdU und genomischer Gesamt-DNA-Färbung über Propidiumiodid durchgeführt werden. Dieses Verfahren vermeidet die Notwendigkeit von chemischen Synchronisation der Rad-Zellen, wodurch die Einführung von nicht-spezifischen DNA-Schäden, die sich wiederum auf den Ablauf des Zellzyklus.
Abstract
Präzise Kontrolle der Einleitung, die Progression durch die verschiedenen Phasen des Zellzyklus sind von größter Bedeutung in proliferierenden Zellen. Handy-Zyklus-Teilung ist ein integraler Bestandteil von Wachstum und Vermehrung und Deregulierung wichtiger Zellzyklus Komponenten in den auslösende Ereignisse der Karzinogenese 1,2 gebracht. Molekulare Wirkstoffe in Anti-Krebs-Therapien zielen häufig biologische Pfade für die Regulation und Koordination von Zellzyklus-Division 3. Obwohl Zellzykluskinetik bis nach Zelltyp unterschiedlich neigen, ist die Verteilung der Zellen unter den vier Phasen des Zellzyklus und nicht konsistent innerhalb einer bestimmten Zelllinie durch die ständige Praxis Mitogen und Wachstumsfaktor Ausdruck. Gentoxische Ereignisse und andere zelluläre Stressoren können in einem temporären Block des Zellzyklus führen, was zu einer vorübergehenden Festnahme oder Pause in einer bestimmten Zelle Zyklusphase für Institutionen ermöglichensuchung der entsprechenden Antwort-Mechanismus.
Die Fähigkeit, experimentell zu beobachten, das Verhalten einer Zellpopulation mit Bezug auf die Zellzyklusprogression Stufe ist ein wichtiger Fortschritt in der Zellbiologie. Gemeinsame Verfahren wie die mitotische abzuschütteln, differentielle Zentrifugation oder auf Basis der Durchflusszytometrie Sortierung werden verwendet, um Zellen in bestimmten Phasen des Zellzyklus 4-6 zu isolieren. Diese fraktionierte, Zellzyklus-Phase angereicherte Populationen werden dann auf experimentelle Behandlungen unterzogen. Ausbeute, Reinheit und Lebensfähigkeit der getrennten Fraktionen können oft kompromittiert Verwendung dieser physikalische Trennverfahren werden. Wie gut, kann die Zeitspanne zwischen Trennung der Zellpopulationen und dem Beginn der experimentellen Behandlung, wobei die Zellen aus der fraktionierten ausgewählten Zellzyklus-Stadium fortschreiten kann, vor erhebliche Herausforderungen bei der erfolgreichen Umsetzung und Interpretation dieser Experimente.
Andere Ansätze zur Study Zellzyklusstadien umfassen die Verwendung von Chemikalien, um Zellen zu synchronisieren. Behandlung der Zellen mit chemischen Inhibitoren der wichtigsten Stoffwechselprozesse für jede Phase des Zellzyklus sind nützlich bei der Blockierung der Verlauf des Zellzyklus zur nächsten Stufe. Zum Beispiel, begrenzen die Ribonucleotid-Reduktase-Inhibitor Hydroxyharnstoff hält Zellen in der G1 / S Stelle durch die Zufuhr von Desoxynukleotiden, die Bausteine von DNA. Andere bemerkenswerte Chemikalien umfassen eine Behandlung mit Aphidicolin, um eine Polymerase-Inhibitor alpha für G1-Arrest, Behandlung mit Colchicin und Nocodazol, die beide mit mitotischen Spindel stören Zellen in M-Phase zu stoppen und schließlich die Behandlung mit dem DNA-Kettenterminator 5-fluorodeoxyridine zu initiieren S-Phase Festnahme 09.07. Die Behandlung mit diesen Chemikalien ist ein wirksames Mittel zur Synchronisation eines gesamten Population von Zellen in einer bestimmten Phase. Mit Entfernung der chemischen herkommend Zellen den Zellzyklus unisono. Die Behandlung des Testmittels folgenden Releaseaus dem Zellzyklus blockierende chemische sichergestellt, dass die Reaktion auf Arzneimittel hervorgerufen von einer gleichförmigen, Phase des Zellzyklus-spezifischen Population ist. Allerdings sind da viele der chemischen Synchronisierungen genotoxische Verbindungen bekannt, Hänseleien auseinander die Beteiligung der verschiedenen Response-Wege (zu den Synchronisierungen im Vergleich zu den Test-Agenten) ist eine Herausforderung.
Hier beschreiben wir eine Methode zur metabolischen Markierung nach einer Subpopulation von Zellen aktiv Radfahren durch ihre Progression aus der DNA-Replikation Phase, durch die Teilung und Trennung von ihren Tochterzellen. In Verbindung mit Durchflusszytometrie Quantifizierung ermöglicht dieses Protokoll für die Messung der kinetischen Fortschreiten des Zellzyklus in Abwesenheit von entweder mechanisch oder chemisch induzierte zelluläre betont gewöhnlich mit anderen Zellzyklus-Synchronisation Methoden 10 zugeordnet ist. In den folgenden Abschnitten werden wir die Methodik, sowie einige seiner Anwendungen in der biomedizinischen Forschung.
Protocol
Discussion
Durch die Kombination von Durchflusszytometrie mit BrdU-Einbau, wir haben die notwendigen Werkzeuge, um die Kinetik des Zellzyklus zu studieren. Das markante Eigenschaft von BrdU als Thymidinanalogon funktionieren ist das, was für DNA-Gehalt Quantifizierung einer Rad-Zelle. Der Einbau von BrdU in einen wachsenden Tochter-DNA-Strang während der Synthese-Phase des Zellzyklus ist, was erlaubt es, eine Subpopulation von Zellen handelt durch die Replikation der DNA in S-Phase zu folgen, einer Wachstumsphase bei G2 und schl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Andy Johnson von der Biomedical Research Center an der UBC für die Unterstützung bei FACS-Analyse. Cancer Research Funding im Wong Laboratory wird von der kanadischen Krebsgesellschaft Research Institute (Betriebskostenzuschuss # 019250) und vom Forschungszentrum Reinvestment Mittel der Fakultät für Pharmazeutische Wissenschaften, UBC zur Verfügung gestellt. JMYW wird durch die Forschung Kanada Stühle und der Michael Smith Foundation for Health Research Career Development Programme unterstützt.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| bromodeoxyuridine | Becton Dickinson | 55089 | |
| propidium iodide | Sigma | 287075 | 1mg/ml stock |
| FITC anti-BrdU | Becton Dickinson | 347583 | |
| sodium tetraborate | Fisher | S80172 | 0.1M, pH 8.5 |
| FACS Caliber | Becton Dickinson |
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