我们提出了一个快速(的定量免疫共沉淀结合击倒)的方法,前面介绍的区分真假蛋白质 – 蛋白质相互作用的变化。我们的做法是根据<sup> 15N</sup>代谢标记,ATP,免疫沉淀,并定量质谱的存在/不存在的蛋白质 – 蛋白质相互作用的亲和力的调制。
许多生物过程在细胞内蛋白质 – 蛋白质相互作用的基本。因此,他们的特性中起着重要的作用,目前的研究和大量的方法,他们的调查的情况1。蛋白质-蛋白质相互作用往往是高度动态的,可能取决于亚细胞定位,翻译后修饰的蛋白环境2。因此,他们应该在自然的环境中进行调查,免疫共沉淀的方法的方法选择3。无目标的方式有针对性的方法,或通过质谱法(LC-MS/MS)的免疫共沉淀的互动合作伙伴确定。后一种策略往往带来不利影响,大量的假阳性发现,主要来自现代质谱仪的高灵敏度,自信地检测非特异性沉淀蛋白质的痕迹。一个recen吨来克服这个问题的方法是基于这样一种想法,减少量的特异性相互作用伙伴将共沉淀物,而与给定的目标蛋白的细胞浓度降低通过RNAi非特异性沉淀蛋白质的量应该是不受影响。这种做法,被称为快速为定量免疫共沉淀结合击倒4,采用稳定同位素标记的氨基酸在细胞培养(SILAC)和MS量化的从野生型和敲株免疫沉淀的蛋白质。以1:1的比例发现的蛋白质可以被认为是污染物,从野生型的靶蛋白的特异性相互作用伙伴沉淀富集。虽然创新,QUICK不承担一些限制:第一,SILAC成本密集型的和有限的,理想的做法是营养缺陷型的精氨酸和/或赖氨酸的生物体。此外,当供给重精氨酸,精氨酸 – 脯氨酸的相互转换结果在ADDIT有理质量位移的每个脯氨酸肽,稍微冲淡了重与轻的精氨酸,这使得量化比较繁琐的,不准确的5,6。其次,QUICK要求抗体滴定,使得它们不会成为击倒突变体的提取物与目标蛋白的饱和。
在这里,我们介绍一种改良的快速协议,它克服了上述局限性,快速取代SILAC为15 N代谢标记,利用RNA干扰技术敲除蛋白质-蛋白质相互作用的亲和调制取代。我们展示了适用本协议使用的单细胞绿藻莱茵衣藻作为模式生物为目标蛋白7( 图1)的的叶绿体HSP70B伴侣。是已知的HSP70s互动的与特定的合作伴侣和基板仅在ADP状态8。我们利用该特性作为一种手段来验证的具体与核苷酸交换因子CGE1 9,互动的HSP70B。
我们最近推出了两项改进的快速方法:为捕获瞬态蛋白质-蛋白质相互作用(QUICK-X),交联步骤和控制沉淀正常化不平等的沉淀效率。在这里,我们提出了一个协议,包含更多的改进的QUICK:第一,我们用SILAC 5 15 N代谢标记。它的优点是,15 N代谢标记是便宜得多的SILAC 15 N,如果是简单的无机盐。此外,用15 N代谢标签QUICK可以施加到生物体的原养型可用于所有的氨基酸,,类似大多数植物,真菌和细菌。最后,精氨酸-脯氨酸的相互转换固有的SILAC 5,6不提出一个问题15 N标记的肽进行定量。为15 N蛋白组学数据的定量评估合适的工具的例子是MSQUANT 12或IOMIQS 13。
第二,我们引入亲和调制作为一个装置,用于具体地在一个样品中,与另一个与一个给定的靶蛋白相互作用的蛋白质的量降低。这种方法的优点是,它绕过敲除突变体的建造,这对于一些模型系统是难以生成,或在所有必需的靶蛋白的情况下,无法生成。此外,它避免了可能发生作为敲减的靶蛋白的细胞响应的差异蛋白质表达所引起的误解:如果其他蛋白质下调和交叉反应的抗血清用于免疫沉淀,它们将被解释真正的互动合作伙伴的目标蛋白。最后,亲和调制废除找到一个适当的抗体的抗原比的需要。
虽然我们我们的协议作为模式生物衣藻,它可以容易地适应于任何其他有机体,可以在细胞培养中生长,并且能够使用铵盐或硝酸盐作为氮源。亲和的蛋白质复合物的调制由ATP / ADP可能直接被施加到其他的分子伴侣,其依赖于ATP的状态与基板和队列的蛋白质的相互作用,,像GroEL/HSP60/Cpn60或HSP90分子伴侣系统14,15,或以任何其他系统约束力的亲和力调制ATP。亲和调制也应该工作由特定的药物,如根赤壳菌素或格尔德霉素在HSP90的系统15的情况下被改变的情况下蛋白质的相互作用之间的亲和度。
我们的协议的明确的限制是它需要已知是敏感到一个特定的处理/调制其亲和性的伴侣蛋白的药物对靶蛋白的亲和纯化的抗体。因此,它是没有的高通量方法。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢奥利维尔博瓦隆的抗血清CF1β。这项工作是由马克斯·普朗克学会和德意志研究联合会(薛定谔617/5-1)和Bundesministerium的教化和Forschung(献给系统生物学计划FORSYS的项目GoFORSYS)的补助。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
ProteinA Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
DMP (Dimethyl pimelimidate) | Sigma-Aldrich | D8388 | Store desiccated at -20 °C, dissolve directly before use |
Protease inhibitor (complete, EDTA-free) | Roche Applied Science | 11873580001 | |
ATP (Adenosin-5′-triphosphat) | Carl Roth | K054 | |
Creatine phosphate | Sigma-Aldrich | 27920 | |
Creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C7886 | |
DSP Dithiobis [succinimidyl propionate] | Thermo Sientific | 22585 | Store desiccated at 4 °C |
15NH4Cl | Cambridge isotope laboratories, Andover, MA | NLM-467 | |
Lys-C (Endoproteinase Lys-C) |
Roche Applied Science | 11047825001 | |
Trypsin beads (Poroszyme Immobilized Trypsin) | Applied Biosystems | 2-3127-00 | Mix vigorously directly before use |
Empore C18 47 mm Disk | Varian | 12145004 |