Summary

Протокол для идентификации белок-белковых взаимодействий на основе<sup> 15</sup> N Метаболический маркировки, Иммунопреципитация, Количественный масс-спектрометрии и Affinity модуляции

Published: September 24, 2012
doi:

Summary

Мы представляем изменения БЫСТРО (количественные Иммунопреципитация в сочетании с Нокдаун) подход, который был введен ранее различать истинные и ложные белок-белковых взаимодействий. Наш подход основан на<sup> 15N</sup> Метаболических маркировки, модуляция сродства белок-белковых взаимодействий по наличию / отсутствию АТФ, иммунопреципитации и количественного масс-спектрометрии.

Abstract

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.

Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

Protocol

1. Антитела адсорбции Взвесить 120 мг белка сефарозой в 15-мл коническую трубку (Falcon). Как 15 мг белка сефарозе необходимы для каждого иммунопреципитации (IP) этого количества достаточно для 8 IP-адресов. Добавьте 5 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4), и пусть белка сефарозой волнения в течение 30 мин при 4 ° C. (Заметим, что все шаги, начиная с этого момента необходимо проводить в перчатках, чтобы избежать загрязнения с кератином и на льду, чтобы избежать деградации белков / диссоциации комплекса). Центрифуга в течение 60 сек при 1000 мкг и 4 ° C для осаждения белков опухшие сефарозой. Осторожно удалите супернатант и ресуспендируют бусины в 5 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4). Повторите этот шаг три раза мыть шарики тщательно. После последнего шага центрифугирования, удаления супернатанта и оставить примерно 0,5 мл фосфатного буфера. Добавить 0,9 мл 0,5 М фосфатного буфера (рН 7,4), 400мкл аффинно очищенные первичные антитела (50 мкл на IP) по отношению к белку-мишени (здесь HSP70B) и 16 мкл антител против белка контроля (здесь CF1β). Залейте DDH 2 O до общего объема 5 мл. (Заметим, что аффинно очищенные антитела должны быть использованы для уменьшения загрязнения неспецифические IgG,, которые мешают нано-LC-MS анализа – для протокола см. Willmund и др. (2005) 10 CF1β осаждается в виде управления загрузкой и был выбран.. потому что это есть в изобилии и, после лизиса клеток, присутствующих в растворимых и мембранных фракций. Кроме того, уровни загрязняющих белков могут быть использованы для нормализации для неравномерной нагрузке.) Разрешить белка сефарозой бисером адсорбировать IgG, во время 1-часовой инкубации при 25 ° С на трубе ролик (CAT RM5W, 36 мин). Центрифуга в течение 60 сек при 1000 мкг и 4 ° C для осаждения белков сефарозой бисера. Осторожно удалите супернатант и гesuspend бусы в 5 мл 0,1 М бората натрия буфером (рН 9,0). Повторите это действие три раза, чтобы полностью удалить амины, которые бы утолить сшивающего агента. Взвесить 25,9 мг свежие, твердые dimethylpimelimidate и ресуспендируют она в 5 мл 0,1 М бората натрия буфером (рН 9,0) для получения конечной концентрации 20 мМ. Добавить это решение белка сефарозой бисера. Разрешить IgG, перекрестно ссылка белка в течение 30 мин при 25 ° С на трубе ролик. Центрифуга в течение 60 сек при 1000 мкг и 4 ° C для осаждения бисера. Осторожно удалите супернатант и ресуспендируют бусины в 5 мл 1 М Трис-HCl (рН 7,5), чтобы утолить бесплатно сшивающего агента. Повторите этот шаг еще раз и выдержать в течение 2 ч при 25 ° C или 12-24 ч при 4 ° С на трубе ролик. Дополнительно: если белка сефарозой бисером связан с IgG, которые непосредственно не используются для IP, для хранения до одной недели возможно. Для этого центрифуге в течение 60 сек при 1000 мкг и 4 ° C для осаждения бусы, осторожно удалите supernatant и ресуспендируют бусины в 5 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,5), содержащем 0,02% азида натрия и хранят при 4 ° С до дальнейшего использования. 2. Лизиса клеток, сшивания и подготовки проб Вырастить два Chlamydomonas культуры в среде, содержащей 7,5 мМ 14 NH 4 Cl или 15 NH 4 Cl в качестве источника азота до плотности ~ 5 х 10 6 клеток / мл. Клетки должны пройти по крайней мере, десять поколений для полной маркировки. Здесь, клетки были выращены photomixotrophically в среде TAP 11 на вращательное шейкере при 25 ° C при непрерывном облучении белым светом (30 мкЕ м -2 с -1). Передача две аликвоты каждого из 14 N и 15 N-меченых клеток до четырех GSA труб и урожай клеток 4-мин центрифугирования при 4000 х г и 4 ° C (номер ячейки собирают для каждой аликвоты зависит от сотовой концентрации целевой белка и должна быть определена электроннойmpirically заранее, чтобы обеспечить необходимый уровень белка-мишени выпадает в осадок. Хорошей отправной точкой является 10 9 клеток на аликвоты, т. е. 200 мл культуры с 5 х 10 6 клеток / мл.) Для сшивания только: в случае белковых комплексов будут сшиты до IP, клетки должны быть промывают, чтобы удалить аминов, присутствующих в среду. Для этого ресуспендирования клеток в 40 мл предварительно охлажденного KH буфера (20 мМ HEPES-KOH (рН 7,2), 80 мМ KCl) и передавать их в 50-мл Сокол труб. Центрифуга в течение 60 сек при 1000 мкг и 4 ° C. Повторите этот шаг один раз. Ресуспендируют клеток в 2 мл буфера для лизиса (20 мМ HEPES-KOH (рН 7,2), 1 мМ MgCl 2, 10 мМ KCl, 154 мМ NaCl), предварительно охлаждают до 4 ° C и передавать их в 15-мл Сокол труб. Соберите оставшиеся клетки в трубах GSA с дополнительным 1 мл буфера для лизиса каждый. Добавить 50 мкл 25 х ингибитор протеазы и 12,5 мкл 1 М MgCl 2 (до конечной концентрации 3,5 мм) для каждой аликвоты. Добавить 150мкл буфера для лизиса, 12,5 мкл 1 М ATP, 833 мкл 270 мМ фосфата креатина и 7 мкл 5 мкг / мкл креатинфосфокиназы (конечная концентрация составляет 2,5 мМ АТФ, 45 мМ креатинфосфата и 7 мкг / мл креатинфосфокиназы) к одному из аликвоты, содержащие 14 N и 15 N-меченых клеток (это + АТФ аликвоты). Добавить 930 мкл буфера для лизиса и 70 мкл 1 ед / мкл апиразы к другой аликвоты, содержащие 14 N и 15 N-меченых клеток (эти-ATP аликвоты). Выдержите в течение 2 мин при 25 ° С на трубе ролик установить ATP-разрушающих и АТФ-изобилует государства. Если сшивание шаг пропущен, добавить еще 1 мл буфера для лизиса. Для сшивания только: в случае, если исследуемый белок-белковых взаимодействий являются переходным желательно, чтобы захватить их сшивания шаг. Для этого добавьте 500 мкл 20 мМ дитио-бис (сукцинимидил пропионат) (DSP) растворяли в ДМСО (конечная концентрация составляет 2 мм) до еАх трубки непосредственно перед обработкой ультразвуком. Разрушать ультразвуком в четыре раза 20 секунд на льду сломать клетки с 20-сек перерывами для охлаждения. (Мы используем Bandelin Sonoplus HD2070 с KE76 наконечник на выходе контроль 75% и рабочий цикл 60%. Необходимые настройки для других машин / устройств / советы должны быть определены заранее, чтобы обеспечить полный лизис клеток и, чтобы не замарать. ) Для сшивания только: позволяет белковых комплексов для сшивания путем инкубации в течение 1 ч при 4 ° С на трубе ролик. После сшивания, дополняют друг трубки с 500 мкл 1 М глицин и инкубировать на трубе ролик в течение еще 15 мин при 4 ° C, чтобы утолить бесплатно сшивающего агента. Подготовьте четыре 6-мл сахарозы подушки (20 мМ HEPES-KOH (рН 7,2), 0,6 М сахарозы) в SW41 Ti тонкие стенки труб (Beckman Coulter Пункт №: 344059), аккуратно положите всего ~ 5,5 мл клеточных лизатов на сахарозу Подушки (баланс с буфером для лизиса) и центрифуги в течение 30 мин при 200000 х г и 4 ° C в SW41 Ti ротор. Переезд в верхней части градиента, содержащих растворимые белковые комплексы на четыре 15-мл пробирки Falcon (во избежание передачи части сахарозы подушке), добавить 350 мкл 10% Triton X-100 до конечной концентрации от 0,5% до каждого из них, тщательно перемешать и добавить лизис буфера в общем объеме 7 мл каждая. (Передача 70 мкл каждого растворимого экстракта клеток на свежий 1,5-мл конические пробирки (Эппендорфа) и добавить 70 мкл 2 х SDS-буфера для образца (4% SDS, 125 мМ Трис-HCl (рН 6,8), 20% глицерина, 10 % 2-меркаптоэтанола), чтобы каждый для SDS-PAGE и иммуноблот анализа.) Откажитесь от сахарозы подушки и ресуспендирования мембраны гранул в 3 мл буфера для лизиса каждый. Добавить в каждую по 1 мл 10% Тритон Х-100 до конечной концентрации 2%, разрушать ультразвуком на льду для растворения гранул, а также добавить буфер для лизиса до общего объема 5 мл каждая. Подготовьте еще четыре 6-мл подушки сахарозы в SW41 Ti тонких трубок стене, лежал ~ 5 мл растворенного мембран, начиная с шага 2,10 внимательно на сахарозуподушки, и центрифуги в течение 30 мин при 200000 х г и 4 ° С в роторе SW41 Ti. Переезд в верхней части градиента, содержащих комплексы мембранного белка на четыре 15-мл пробирки Сокол и добавить лизис буфера (содержащего 2% Triton X-100) до конечного объема 7 мл каждая. (Передача 70 мкл каждого растворимого экстракта клеток на свежий Эппендорфа и добавить 70 мкл 2 х SDS-образца для каждого SDS-PAGE и иммуноблот анализа.) 3. Иммунопреципитация Гранулы белков сефарозой гранулы, содержащие связанные антитела (с шагом 1,8 или 1,9) по 60-сек центрифугированием при 1000 х г и 4 ° C, осторожно удалите супернатант и ресуспендируют бусины в 4 мл буфера для лизиса. Повторите этот шаг дважды, чтобы уравновесить бусины в буфере для лизиса. Заполнить до 8 мл буфера для лизиса и передать 1 мл суспензии для каждого из восьми 15-мл пробирки Сокол содержащие растворимые или мембранных комплексов белка с АТФ-сытые и АТФ-разрушающих 14 </sдо> N и 15 N-меченых клеток (с шагом 2,9 и 2,12). Выдержите в течение 2 ч при 4 ° С на трубе ролик комплексов осадок белка. Пелле бисера 60-сек центрифугированием при 1000 х г и 4 ° C и отбросить супернатант. Оставьте небольшой объем жидкости в верхней части бусины для облегчения передачи. Передача бусины из каждой пробирки Сокол 1,5-мл конические пробирки (Eppendorf трубки). Чтобы собрать все оставшиеся бусины в трубах Falcon, добавить еще 0,8 мл буфера для лизиса, содержащего 0,1% Triton друг, вихревой мягко, центрифуги в течение 60 сек при 1000 мкг и 4 ° C и передача буфера с остаточным бисером Эппендорфа. Труба обмена необходимо для предотвращения загрязнения из белков придерживаясь пластиковые стены. Пелле бисера 15-сек центрифугирования при 16100 х г и 4 ° C, осторожно удалите супернатант и ресуспендируют бусины в 1,3 мл буфера для лизиса, содержащего 0,1% Triton. Повторите этот шаг дважды лизис буферафер содержащие Triton и в два раза буфером для лизиса не хватает Triton тщательно мыть шарики. Оставьте небольшой объем жидкости в верхней части бусины для облегчения передачи. Опять же передать бисером на свежий 1,5-мл Eppendorf трубы для удаления белков, придерживаясь пластиковые стены. Вымойте старых труб с 1 мл буфера для лизиса не хватает Triton и передать все остаточные бисером свежие труб. Центрифуга в течение 15 сек при 16100 х г и 4 ° C, удалите супернатант сначала с нормальной пипетки, затем удалите оставшуюся супернатант полностью с 50-мкл шприца Гамильтона. 4. Подготовка проб для nano-LC-MS/MS Добавить 100 мкл свежеприготовленного элюции буфером (8 М мочевины, 25 мМ NH 4 HCO 3) в каждую пробирку, используя 100 мкл буфера элюирования, чтобы смыть бисером придерживаться шприца Гамильтона и инкубировать в течение 10 мин в Thermomixer при 800 оборотах в минуту и 65 ° C, а в течение еще ​​20 мин при 30 ° С (более полныйэлюирование связанных белков достигается за счет вымывания с 2% SDS осадков и последующие с 80% ацетона.) Центрифуга в течение 15 сек при 16100 мкг и 25 ° C. Передача супернатантов на свежий трубы с 50-мкл шприца Гамильтона. Добавить 50 мкл буфера для элюции с бисером, использовать 50 мкл буфера элюирования, чтобы смыть бисером придерживаться шприца Гамильтона и повторить инкубации и центрифугирования шаги 4,1 и 4,2, соответственно. Бассейн соответствующих элюатов. (Передача 30 мкл элюатов на свежий трубы Эппендорф, добавить 30 мкл 2 х SDS-буфера для образца, чтобы каждый для SDS-PAGE и иммуноблот анализа.) Комбинат Элюированную выпадает из + /-АТФ-лечение, 14 N и 15 N-меченных растворимых и мембранных белков следующим образом: 120 мкл 15 N / + АТФ и 120 мкл 14 N /-ATP 120 мкл 14 N / + АТФ и 120 мкл 15 N /-ATP 120 мкл 15 N / + АТФ и 120 мкл 14 N /-ATP <бр /> 120 мкл 14 N / + АТФ и 120 мкл 15 N /-ATP Добавить 1,5 мкл свежеприготовленного 1 M DTT до конечной концентрации 6,5 мМ каждого из четырех комбинаций для уменьшения дисульфидные связи (в том числе в сшивателя) и инкубировать в течение 30 мин при 25 ° C. Добавить 10,5 мкл свежеприготовленного 0,6 М иодацетамида до конечной концентрации 25 мМ до carboxymethylate пониженной тиолов и инкубировать в течение 20 мин при 25 ° C в темноте. Добавить 256 мкл 40 мМ NH 4 HCO 3 и 4 мкл Lys-C (0,1 мкг / мкл), печать труб с парафином, и инкубировать в течение по крайней мере 16 часов ночи на вращение колес при 37 ° C. Добавить 470 мкл 20 мМ NH 4 HCO 3, 10 мкл 100% ацетонитрила (до конечной концентрации 1%) и 8 мкл бисером трипсина, и инкубировать на вращение колеса по крайней мере 16 часов при 37 ° C. Центрифуга течение 5 мин при 16100 х г и 4 ° C, а супернатанты передачи на свежий 2-мл Eppendorf ваннойES. Вымойте старой трубы с 50 мкл 20 мМ NH 4 HCO 3, 0,5% уксусной кислоты, и бассейн с первым супернатантах. Для обессоливания, готовить домашние C 18-StageTips путем вырезания из двух дисков Empore C 18 материал с иглой шприца и размещение их в 200-мкл пипетки. Таким образом подготовить четыре 200-мкл советы. Пробивать отверстия в крышках из четырех 2-мл пробирки Eppendorf и вставки советов. Условие C 18-StageTips с 50 мкл раствора В (80% ацетонитрила, 0,5% уксусной кислоты). Центрифуга течение 3 мин при 800 г и 25 ° C. Уравновесьте C 18-StageTips с 100 мкл раствора (0,5%-ной уксусной кислоты, 2% ацетонитрил). Центрифуга течение 3 мин при 800 г и 25 ° C. Повторите этот шаг один раз. Загрузите 100 мкл супернатантов от триптического пищеварения (4,9) на C 18-StageTips и центрифуги в течение 3 мин при 800 г и 25 ° C. Повторяйте этот шаг до полного супернатанты были применены кстолбцы. Вымойте C 18-StageTips 100 мкл Центрифуга А. Решение течение 3 мин при 800 г и 25 ° C. Повторите этот шаг дважды. Элюировать триптических пептидов в свежий 1,5-мл трубки Эппендорф с 50 мкл раствора B. центрифуги в течение 3 мин при 800 г и 25 ° C. Повторите этот шаг один раз. Сухие пептиды до завершения в скорости переменного тока. Дополнительно: печать Эппендорфа с парафином и хранят при температуре -80 ° C до дальнейшего использования. Ресуспендируют сушеные пептидов с 20 мкл раствора и инкубировать в течение не менее 1 часа на льду, прервал на два 15-минутных инкубации в ультразвукового ванны. Центрифуга течение 20 мин при 16100 х г и 4 ° C, и применять супернатанта nano-LC-MS/MS. 5. Представитель Результаты Как показали образцово на 14 N-меченных клеточных экстрактов в рисунке 2А, HSP70B и CGE1 почти исключительно локализованы в растворимой фракции, независимые от государства АТР. ВНапротив, CF1β локализуется в растворимых и мембранных обогащенных фракций, а ультразвуком ножницы частью его от мембраны расположены CF-о, и, следовательно, служит в качестве контроля загрузки для обеих фракций. Как показано на Рисунке 2B, одинаковое количество HSP70B осаждали с анти-HSP70B антител из 14 N и 15 N-меченных растворимых экстрактов, независимых от государства АТР. В противоположность этому, только немного HSP70B осаждали из мембранных фракций с немного большем количестве, происходящих из АТФ-обедненной фракции мембран по сравнению с ATP изобилует фракций, следовательно, подтверждающие ранее результаты 9. Нет CGE1 был совместно осаждают HSP70B в ATP-изобилует растворимый или мембранной фракции, в то время как большое количество CGE1 были совместно осаждают HSP70B из АТФ обедненного растворимых фракций, и немного от ATP-обедненной фракции мембран. Взаимодействие с CGE1 HSP70B только в состоянии ADP наблюдается также вMS анализа: на рисунке 3, представитель MS1 спектров HSP70B и CGE1 пептидов из осадка, созданных с помощью HSP70B антисыворотки от растворимых клеточных экстрактов показано. В эксперименте показано на рисунке 3А, осадок из смеси 14 N-меченных экстракты не хватает АТФ и 15 N-меченных экстракты, содержащие ATP. В то время как тяжелые и легкие формы помечены HSP70B пептида были обнаружены при равной интенсивности, только свет помечены форме CGE1 пептид (от АТФ выдержки) был найден. На рисунке 3B же пептиды из анти-HSP70B осадок, полученных из смесей взаимно меченого растворимого экстракта клеток показано на рисунке. Соответственно, на этот раз только тяжелые помечены формы пептида CGE1 (от ATP-экстракты) было обнаружено, в то время это был снова случай для обоих, легкой и тяжелой меченых пептидов HSP70B. <сильная> Рисунок 1. Экспериментальный процесс. Клетки метаболически меченных 14 N и 15 N в течение по крайней мере 10 поколений, собирают и поставляется с обедненным или от СПС. После лизиса клеточных комплексов белков необязательно может быть сшитым (X-Link) с DSP. Лизированных клеток отделяются в растворимой (Sol) и мембранный обогащенный (PEL) фракций. Целевая белков (здесь HSP70B) и контрольного белка (здесь CF1β), которые иммунопреципитации с специфических антител связан с белком сефарозе бисером (черный). После промывки осажденного белки элюируют и непосредственно проанализированы с помощью иммуноблоттинга или соответствующих 14 N и 15 N-меченных фракций + АТФ и АТФ государства объединяют, перевариваются и проанализированы nano-LC-MS/MS. В примере, показанном случае здесь 15 N-меченных фракции был исчерпан от СПС. Соответственно, соотношение интенсивностей тяжелых маркировкой (темного цвета), чтобы осветить маркировкой (светлых тонов) пептидов из белков контроль(CF1β), белка-мишени (HSP70B) и неспецифически связанного загрязнений должно быть около одного, в то время как этот показатель ожидается на очень высоком для белков конкретно взаимодействует с белком-мишенью (CGE1). Нажмите, чтобы увеличить показатель . Рисунок 2. Анализ вход для иммунопреципитации HSP70B. Общий белок был извлечен из растворимых (Sol) и мембранный обогащенный (PEL) фракций либо истощены от АТФ (АТФ) или дополнены с АТФ и АТФ система регенерации (+ АТФ). 0,01% белка экстракты разделяют на 10% SDS-полиакриламидном геле, и уровни HSP70B и CGE1 белка по сравнению с контролем загрузки CF1β были проанализированы с помощью иммуноблоттинга. B Анализ иммунопреципитатах. HSP70B был иммунопреципитации из 14 N-и15 N-меченных растворимых и мембранных обогащенного клеточные экстракты, содержащие или не хватает АТФ. Белки соответствующего 3,3% иммунопреципитатах были разделены на 10% SDS-полиакриламидном геле и уровней HSP70B и CGE1 относительно контроля загрузки CF1β были проанализированы с помощью иммуноблоттинга. Нажмите, чтобы увеличить показатель . Рисунок 3. Представитель масс-спектры HSP70B и CGE1 пептидов из анти-HSP70B иммунопреципитаты осуществляется на смешанной растворимых фракций (14 N-ATP / 15 N + АТФ). Полный спектр МС 14 N и 15 N меченых пептидов, соответствующих АТФ и + ATP государства, соответственно, от HSP70B и сотрудничество иммунопреципитации CGE1 показано. Оба пептиды трехзарядных, пептид HSP70B содержит 22 атомов азота, CGE1 peptязь 19, соответствующий сдвиг массы, равного 7,33 и 6,33 м / г, соответственно. B представителя масс-спектров от обратного эксперимента (14 N + ATP / 15 N-АТФ). Полный спектр MS того же 14 N и 15 N меченых пептидов, вот соответствующая + АТФ и АТФ государства, соответственно, от HSP70B и сотрудничество иммунопреципитации CGE1 показано. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Discussion

Мы недавно представил два усовершенствования быстрый подход: сшивание шаг для захвата переходных белок-белковых взаимодействий (QUICK-X), и контроль осадков нормализовать для неравных эффективность осадков 6. Здесь мы приводим протокол, содержащий два более быстрых улучшений: во-первых, заменить SILAC 5 по 15 N метаболических маркировки. Преимущество в том, что 15 N метаболических маркировки гораздо дешевле, чем SILAC, если 15 N предоставляется как простые неорганические соли. Кроме того, с 15 N метаболических маркировки Быстрый могут быть применены к прототрофный организмов для всех аминокислот, как и большинство растений, грибов и бактерий. И, наконец, аргинин-на-пролина взаимопревращения присущие SILAC 5,6 не представляет проблемы для количественной оценки 15 N меченых пептидов. Примеры подходящих инструментов для количественной оценки 15 N протеомики данных MSQUANT 12 или яOMIQS 13.

Во-вторых, введем близость модуляции в качестве средства специально для уменьшения количества белков, взаимодействующих с данным белком-мишенью в одном образце по сравнению с другой. Преимущества этого подхода в том, что она обходит строительства нокдаун мутантов, которые для некоторых моделей системы трудно генерировать или не могут быть созданы на всех в случае существенного белков-мишеней. Кроме того, это позволяет избежать неправильного толкования вызвана дифференциальной экспрессии белка потенциально возникающих как ответ клетки на стук вниз белка-мишени: если другие белки вниз регулируется также и перекрестную реакцию с сывороткой для иммунопреципитации, они будут интерпретированы в качестве полноправных партнеров взаимодействия белка-мишени. Наконец, близость модуляции отменяет необходимость нахождения надлежащего антитела к антигену отношение.

Хотя мы применяем наши протокол к Chlamydomonas reinhardtii в качестве модельного организма, Она может быть легко адаптирована к любой другой организм, который можно выращивать в культуре клеток и может использовать нитрат аммония или в качестве источника азота. Affinity модуляции белковых комплексов АТФ / АДФ могут быть непосредственно применены к другим сопровождающим, взаимодействие с субстратами и когорты белков зависит от состояния СПС, как GroEL/HSP60/Cpn60 или HSP90 шаперона системы 14,15, или на любой другой системе, где сродства модулируются СПС. Affinity модуляции также должны работать для случаев, когда сходство между белковых взаимодействий изменены определенные лекарственные препараты, как radicicol или гелданамицина в случае HSP90 системы 15.

Четкое ограничение нашего протокола является то, что она требует аффинно очищенные антитела к белку-мишени, как известно, чувствительны к специфического лечения / препарат, который модулирует его сродство к партнеру белков. Таким образом, это не высокая пропускная способность метода.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Оливье Vallon для антисыворотки против CF1β. Эта работа была поддержана Общества Макса Планка и гранты от Deutsche Forschungsgemeinschaft (Шредингера 617/5-1) и Bundesministerium für Bildung унд Forschung (Systems Biology инициатива Forsys, проект GoFORSYS).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
ProteinA Sepharose Sigma-Aldrich P3391  
DMP (Dimethyl pimelimidate) Sigma-Aldrich D8388 Store desiccated at -20 °C, dissolve directly before use
Protease inhibitor (complete, EDTA-free) Roche Applied Science 11873580001  
ATP (Adenosin-5′-triphosphat) Carl Roth K054  
Creatine phosphate Sigma-Aldrich 27920  
Creatine phosphokinase Sigma-Aldrich C7886  
DSP Dithiobis [succinimidyl propionate] Thermo Sientific 22585 Store desiccated at 4 °C
15NH4Cl Cambridge isotope laboratories, Andover, MA NLM-467  
Lys-C (Endoproteinase
Lys-C)
Roche Applied Science 11047825001  
Trypsin beads (Poroszyme Immobilized Trypsin) Applied Biosystems 2-3127-00 Mix vigorously directly before use
Empore C18 47 mm Disk Varian 12145004  

References

  1. Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods. J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).
  2. Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 42-49 (2011).
  3. Markham, K., Bai, Y., Schmitt-Ulms, G. Co-immunoprecipitations revisited: an update on experimental concepts and their implementation for sensitive interactome investigations of endogenous proteins. Anal. Bioanal. Chem. 389, 461-473 (2007).
  4. Selbach, M., Mann, M. Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown (QUICK. Nat Methods. 3, 981-983 (2006).
  5. Ong, S. E., Mann, M. A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). Nat Protoc. 1, 2650-2660 (2006).
  6. Heide, H. Application of quantitative immunoprecipitation combined with knockdown and cross-linking to Chlamydomonas reveals the presence of vesicle-inducing protein in plastids 1 in a common complex with chloroplast HSP90C. Proteomics. 9, 3079-3089 (2009).
  7. Nordhues, A., Miller, S. M., Muhlhaus, T., Schroda, M. New insights into the roles of molecular chaperones in Chlamydomonas and Volvox. International review of cell and molecular biology. 285, 75-113 (2010).
  8. Mayer, M. P., Bukau, B. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cell Mol. Life Sci. 62, 670-684 (2005).
  9. Schroda, M., Vallon, O., Whitelegge, J. P., Beck, C. F., Wollman, F. A. The chloroplastic GrpE homolog of Chlamydomonas: two isoforms generated by differential splicing. The Plant Cell. 13, 2823-2839 (2001).
  10. Willmund, F., Schroda, M. HEAT SHOCK PROTEIN 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiol. 138, 2310-2322 (2005).
  11. Harris, E. H. . The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. , (2008).
  12. Mortensen, P. MSQuant, an open source platform for mass spectrometry-based quantitative proteomics. J. Proteome Res. 9, 393-403 (2010).
  13. M?hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. Quantitative Shotgun Proteomics Using a Uniform 15N-Labeled Standard to Monitor Proteome Dynamics in Time Course Experiments Reveals New Insights into the Heat Stress Response of Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).
  14. Bukau, B., Horwich, A. L. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell. 92, 351-366 (1998).
  15. Wandinger, S. K., Richter, K., Buchner, J. The Hsp90 chaperone machinery. J. Biol. Chem. 283, 18473-18477 (2008).

Play Video

Cite This Article
Schmollinger, S., Strenkert, D., Offeddu, V., Nordhues, A., Sommer, F., Schroda, M. A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation. J. Vis. Exp. (67), e4083, doi:10.3791/4083 (2012).

View Video