囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）是一种上皮氯离子通道，已被报道可与多种蛋白质相互作用并调控重要的细胞过程；其中，CFTR通过其PDZ基序介导的相互作用已有充分研究。本实验方案描述了我们建立的用于组装PDZ依赖性CFTR大分子信号复合物的方法 体外.
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摘要
摘要
囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）是一种主要位于上皮细胞顶膜的氯离子通道，在跨上皮液体稳态中发挥关键作用1-3CFTR 与两种主要疾病相关：囊性纤维化（CF）4 分泌性腹泻5在囊性纤维化（CF）中，CFTR Cl- 通道的合成或功能活性降低。该疾病在美国约每2,500名高加索人中影响1人。6CFTR 活性过高也与毒素诱导的分泌性腹泻病例相关。例如，由霍乱毒素和耐热肠毒素 E. coli 肠毒素，可刺激肠道内cAMP或cGMP的产生7.
越来越多的证据表明，囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）与多种其他蛋白质之间存在物理和功能上的相互作用，这些蛋白质包括转运蛋白、离子通道、受体、激酶、磷酸酶、信号分子以及细胞骨架成分。CFTR与其结合蛋白之间的这些相互作用已被证明在体外和体内均对CFTR介导的跨上皮离子转运起关键调控作用in vitro和in vivo8-19。本实验方案仅聚焦于研究CFTR羧基末端尾部（含有一个蛋白质结合基序，即PSD95/Dlg1/ZO-1（PDZ）基序）与一组含有特定结合模块（称为PDZ结构域）的支架蛋白之间相互作用的方法。迄今为止，已有多种不同的PDZ支架蛋白被报道可与CFTR的羧基末端尾部以不同亲和力结合，例如NHERF1、NHERF2、PDZK1、PDZK2、CAL（CFTR相关配体）、Shank2和GRASP20-27。CFTR中被PDZ支架蛋白识别的PDZ基序位于其C末端最后四个氨基酸（即，人CFTR中的1477-DTRL-1480）20。有趣的是，CFTR能够以不同的亲和力同时结合NHERF和PDZK1的多个PDZ结构域22。这种CFTR结合的多价性已被证明具有重要的功能意义，提示PDZ支架蛋白可能有助于在细胞内形成CFTR大分子信号复合物，从而实现特异性/选择性且高效的信号传导16-18。
已开发多种生物化学检测方法用于研究与CFTR相关的蛋白质相互作用，例如免疫共沉淀、拉下实验、成对结合实验、比色成对结合实验以及大分子复合物组装实验16-19,28,29本文重点介绍组装依赖于PDZ基序的包含CFTR的大型分子复合物的详细步骤 体外，该方法被我们实验室广泛用于研究涉及CFTR的蛋白质-蛋白质或结构域-结构域相互作用16-19,28,29.
方案
1. 在细菌中表达和纯化重组标签融合蛋白
- 通过PCR方法扩增CFTR、LPA2、MRP2、MRP4、β2AR和NHERFs（全长或PDZ1或PDZ2结构域）C端尾部（C末端含有PDZ基序的最后50-100个氨基酸）的特定区域。
- 将PCR产物克隆至pGEX4T-1载体以表达GST融合蛋白（如GST-NHERFs、GST-MRP4 CT），克隆至pMAL-C2载体以表达MBP融合蛋白（如MBP-β2AR CT、MBP-CFTR CT），以及克隆至pET30载体以表达His-S融合蛋白（如His-S-CFTR CT、His-S-PDZK1）。
- 将重组质粒转化至蛋白酶缺陷型E. coli菌株（BL21-DE3）中，以最大程度减少重组蛋白的降解。
- 在含有适当抗生素（如氨苄青霉素或卡那霉素）的LB培养基（pH 7.0）中，于37 °C过夜培养。将过夜培养物按1:10稀释后，继续在37 °C培养2小时，随后加入0.5–1 mM IPTG，在30 °C诱导表达4小时。于4 °C下以8,000 × g离心10分钟收集菌体。
- 使用含溶菌酶（1 mg/ml）、0.2% Triton X-100及蛋白酶抑制剂的蔗糖缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，1 mM EDTA，1 mM PM....
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讨论
在本方案中，我们展示了一种方法 体外 使用纯化的蛋白质（或蛋白质片段）和/或细胞裂解液组装并检测含有CFTR的大型信号复合物，方法如先前报道所述16-19,29,30为获得最佳结果，在制备过程中需特别关注以下关键环节：
- 在按照步骤1)纯化GST融合蛋白时，加入还原型谷胱甘肽后，必须将洗脱缓冲液的pH值调节至8.0。加入还原型谷胱甘肽后，pH值可能低至3.0。如果在洗脱前未调节pH值，洗脱效率将显著降低。
- 当蛋白质从珠粒中洗脱后，应立即进行透析；否则，纯化的蛋白质可能从溶液中析出。如果无法在洗脱后立即进行蛋白质透析，则不应进行洗脱，而应将蛋白质保留在琼脂糖/珠粒上。
- 强烈建议不要将用于Western blotting的含CFTR的大分子复合物样品煮沸，因为CFTR聚集是一个常见问题。相反，样品应在上样前于37 °C加热10–15分钟。
- 对于具有低亲和力相互作用的蛋白质复合物，可使用SuperSignal West Femto（或Pico）Maximum Sensitivity Substrate（Pierce）进.......
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致谢
本研究工作得到了美国心脏协会（大东南分会）初期研究资助0765185B、Elsa U. Pardee基金会研究资助以及韦恩州立大学校内启动基金和心血管研究所Isis计划奖项的支持。体外 CFTR大分子复合物组装方法最初由A.P. Naren博士（田纳西大学健康科学中心）首创。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pGEX4T-1 载体 | GE Healthcare | 28-9545-49 | 曾用名 Amersham Biosciences |
| pMAL-C2 载体 | New England BioLabs | ||
| pET30 载体 | EMD Chemicals | 69077-3 | 曾用名 Novagen |
| 谷胱甘肽琼脂糖珠 | BD 生物科学 | 554780 | |
| 直链淀粉树脂 | New England BioLabs | E8021S | |
| Talon 珠 | Clontech | 635501 | |
| 还原型谷胱甘肽 | BD 生物科学 | 554782 | |
| 咪唑 | Fisher | BP305-50 | |
| 麦芽糖 | Fisher | BP684-500 | |
| S蛋白琼脂糖 | EMD Chemicals | 69704-3 | 曾用名 Novagen |
| 抗Flag HRP | Sigma | A8592 | |
| 抗CFTR IgG | 定制 | R1104 | 识别CFTR第722-734位氨基酸表位的单克隆抗体 |
| 抗MRP2 IgG | Chemicon International | MAB4148 | 现为默克旗下 Millipore 的一部分 |
<强>表2. 特定试剂与设备 |
参考文献
- Anderson, M. P. Demonstration that CFTR is a chloride channel by alteration of its anion selectivity. Science. 253, 202-205 (1991).
- Bear, C. E. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance r....
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