L'analyse in vitro de PDZ-dépendants complexes macromoléculaires CFTR de signalisation
Summary
Kystique régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose (CFTR), un canal chlorure épithéliale, a été signalé à interagir avec des protéines et de réglementer divers processus cellulaires importants, parmi lesquels les CFTR PDZ motif-médiées par les interactions ont été bien documentés. Ce protocole décrit les méthodes que nous avons développés pour assembler un macromoléculaire CFTR PDZ-dépendante complexe de signalisation<em> In vitro</em>.
Abstract
Kystique régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose (CFTR), un canal chlorure situés principalement au niveau des membranes apicales des cellules épithéliales, joue un rôle crucial dans l'homéostasie du fluide transépithélial 1-3. CFTR a été impliqué dans deux maladies majeures: la fibrose kystique (CF) 4 et la diarrhée sécrétoire 5. Dans FC, la synthèse ou l'activité fonctionnelle de la protéine CFTR Cl-canal est réduite. Ce trouble affecte environ 1 sur 2500 personnes de race blanche aux États-Unis 6. Activité de la CFTR excessive a également été impliquée dans des cas de toxine induit une diarrhée sécrétoire (par exemple, par la toxine du choléra et de la chaleur entérotoxine stable de E. coli) qui stimule la production de GMPc AMPc ou dans l'intestin 7.
Les preuves qui s'accumulent suggèrent l'existence d'interactions physiques et fonctionnelles entre CFTR et un nombre croissant d'autres protéines, y compris les transporteurs, canaux ioniques, récepteurs, les kinases, les phosphatases, de signauxmolécules ING et éléments du cytosquelette, et ces interactions entre la protéine CFTR et de ses protéines de liaison ont été montré à la critique impliquée dans la régulation de CFTR-médiée transport des ions transépithélial in vitro et également in vivo 8-19. Dans ce protocole, nous nous concentrons uniquement sur les méthodes que l'aide dans l'étude des interactions entre la queue CFTR carboxyle terminal, qui possède un motif liaison aux protéines [dénommé PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], et une un groupe de protéines échafaudage, qui contiennent un module de liaison spécifique dénommé domaines PDZ. Jusqu'à présent, plusieurs différentes protéines d'échafaudage PDZ ont été signalés à se lier à la queue carboxyle terminal de la protéine CFTR avec des affinités différentes, telles que NHERF1, les NHERF2, les PDZK1, les PDZK2, CAL (CFTR associée à un ligand), Shank2, et le GRASP 20-27. Le motif PDZ dans CFTR qui est reconnu par PDZ protéines d'échafaudage est les quatre derniers acides aminés à l'extrémité C-terminale (c.-à-1477-DTRL-1480 chez l'homme CFTR) 20. Il est intéressant,CFTR peut se lier plus d'un domaine PDZ des deux NHERFs et PDZK1, quoique avec plus ou moins d'affinités 22. Cette polyvalence à l'égard de la protéine CFTR contraignant a été démontré que de l'importance fonctionnelle, ce qui suggère que PDZ protéines d'échafaudage peuvent faciliter la formation de complexes de signalisation macromoléculaire CFTR pour la signalisation spécifiques / sélective et efficace dans les cellules 16-18.
Multiples dosages biochimiques ont été développées pour étudier la protéine CFTR-impliquant les interactions entre protéines, telles que la co-immunoprécipitation, pull-down assay, par paire test de liaison, colorimétrique paires test de liaison, et le dosage assemblage macromoléculaire complexe 16-19,28,29 . Nous nous concentrons ici sur les procédures détaillées d'assemblage d'une PDZ motif-dépendante CFTR contenant macromoléculaire complexe in vitro, qui est largement utilisé par notre laboratoire pour étudier protéine-protéine ou un domaine à domaine interactions impliquant la protéine CFTR 16-19,28,29.
Protocol
Discussion
Dans ce protocole, nous avons démontré une méthode in vitro le montage et la détection d'une protéine CFTR contenant un complexe macromoléculaire de signalisation utilisant des protéines purifiées (ou fragments de protéines) et / ou de lysats cellulaires comme indiqué précédemment 16-19,29,30. Pour obtenir les meilleurs résultats sur les points suivants critiques au cours du processus de préparation nécessitent une attention particulière:
- Il est important que le pH du…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Notre travail a été soutenu par des subventions de l'American Heart Association (Grand Sud-affiliation) Début-grant-in-aid 0765185B, l'Elsa U. Pardee Fondation une subvention de recherche, et la Wayne State University intra-muros de fonds de démarrage et de recherche cardiovasculaire de l'Institut d'attribution Initiative Isis. Cette méthode in vitro CFTR assemblage complexe macromoléculaire a été initialement mis au point par le Dr AP Naren (Université du Tennessee Health Science Center).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| pGEX4T-1 vector | GE Healthcare | 28-9545-49 | formerly Amersham Biosciences |
| pMAL-C2 vector | New England BioLabs | ||
| pET30 vector | EMD Chemicals | 69077-3 | formerly Novagen |
| Glutathione agarose beads | BD Biosciences | 554780 | |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | |
| Talon beads | Clontech | 635501 | |
| reduced glutathione | BD Biosciences | 554782 | |
| imidazole | Fisher | BP305-50 | |
| maltose | Fisher | BP684-500 | |
| S-protein agarose | EMD Chemicals | 69704-3 | formerly Novagen |
| Anti-Flag HRP | Sigma | A8592 | |
| Anti-CFTR IgG | Custom-made | R1104 | mAb recognizing CFTR epitope at a.a. 722-734 |
| Anti-MRP2 IgG | Chemicon International | MAB4148 | Now a part of Millipore |
Table 2. Specific reagents and equipment.
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