도구 및 화학 순차적으로 전기없이 샘플의 단백질이어서 핵산을 분리 설명되어 있습니다. 도구는 격리 화학은 고체 상 추출 원리에 기초하는 동안 전송 피펫 내에서 개최 sorbent 구성되어 있습니다. 격리된 macromolecules는 immuno 기반 및 PCR 기반 assays에 의해 분석할 수 있습니다.
이러한 Enterohemorrhagic 대장균 (EHEC), Yersinia pestis의, 또는 prion 기반의 질병 등 전통과 신흥 병원균은 정부, 산업 및 전세계 의료 전문가들을위한 상당한 우려입니다. 예를 들어, 시겔라 결합 EHECs은, 약 325,000 어린이 매년 죽음에 책임이 있으며, 미국에서 일반적인 실험실 기반의 신분은 1 사용할 수없는 개발 도상국 특히 만연한 있습니다. 저렴한 비용의 개발 및 배포는 병원균이나 질병 마커의 신속한 식별 및 / 혹은 진단을 도울 현장 기반, 포인트의 케어 도구가 극적으로 질병의 진행과 환자의 예후를 변경할 수 있습니다. 우리는 전기 또는 관련 실험실 장비이없이 고체 상 추출 (SPE)에 의해 시료로부터 핵산과 단백질을 분리하기위한 도구를 개발했습니다. 격리된 macromolecules는 diagno 사용할 수 있습니다앞으로 실험실 또는 현장 기반 포인트의 케어 플랫폼을 사용하여 두 동생. 중요한 것은,이 방법은 게놈 및 proteomic 분석 확증을 통해 자신감을 제공하고, 핵산 및 해제 분할 시료로부터 단백질 데이터의 직접적인 비교를 제공합니다.
우리 절연 도구는 실리카 기반의 입자 또는 필터를 3으로 바인딩을 통해 chaotropic 소금 용액, 보통 구아니딘의 isothiocyanate에서 핵산을 분리 고체 상 핵산 분리를위한 업계 표준, 붐 기술을 활용합니다. CUBRC의 독점 고체 상 추출 화학은 핵산 분리 네에 따라 폐기물이나 흐름 죽에서,이 경우에는 chaotropic 소금 솔루션에서 단백질을 정화하는 데 사용됩니다.
포장함으로써, 소형 저렴하고 간단한 플랫폼에 화학을 잘 특징, 우리는 VAR하에 수행할 수 핵산 및 단백질 추출을위한 휴대용 시스템을 생성했습니다조건 iety. 분리된 핵산들은 안정이되었고, 단백질 함량은 즉시 개최 손 또는 기타 면역 기반 assays에 의해 분석할 수있는 동안 전원 PCR 증폭에 사용할 수있는 위치로 운반하실 수 있습니다. 분야의 질병 마커의 급속한 신분은 크게 질병 진행의 초기 단계에서 치료의 적절한 과정을 지시하여 환자의 결과를 변경할 수 있습니다. 설명된 도구와 방법은 거의 모든 전염성 요원과 함께 사용하기에 적합하며 동시에 자신의 물류 부담을 줄이면서 사용자에게 멀티 macromolecule 유형 분석의 중복을 제공합니다.
이 보고서에 설명된 도구, 화학 및 프로토콜 필드 기반, 포인트의 케어 애플 리케이션에서 활용할 수있는 전기없는, 멀티 macromolecule 추출 시스템의 첫 번째 알려진 예제를 나타냅니다. 두 macromolecule 종류 하류 진단이나 분석 장치의 숫자에 적용할 수 있습니다. 샘플의 단백질 구성 요소 (그림 4) immunoreactive 반면 예를 들어, 분리된 핵산은 PCR 품질 (그림 2 및 3)입니다. 세계의 금욕이나 리소스가 제한된 지역에서 본 추출 시스템의 활용도가 크게 거기 사는 인구에 대한 질병의 부담을 줄일 수 있습니다. 이 추출 시스템은 또한 금욕 또는 원격 위치에서 시료 처리를위한 견고한 아직 신속하고 비용 효과적인 방법을 제공하여 전세계 질병 감시 프로그램을 도울 수 있습니다.
위에 명시된 추출 방법에 대한 하나의 중요한 요소는 그그것은 사용자가 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 샘플 크기는 초기 500 μLs (단계 1.2)보다 크거나 적은 경우에, 사용자는 이에 따라 시약의 볼륨을 조정할 수 있습니다. 그것은 절대적인 볼륨을 변경할 수 있습니다 반면 샘플 크기 시약의 용적 비율이 일정하게 유지하여야합니다. 또한, sorbent여 구절의 수가 조정은 또한 사용자의 재량으로 만들 수 있습니다. 큰 샘플 볼륨이 사용되는 예를 들어, 나열된 것보다 sorbent 번 이상 (단계 2.4 & 3.3) 이상의 시료를 통과하는 것은 sorbent 연락 macromolecule 유형 (핵산 또는 단백질)의 가능성을 높일 것입니다. sorbent 채도에 도달할 때까지 단락의 증가는 증가 효율성을 캡처해야합니다.
우리는 추출 도구 및 관련 화학은 단백질 추출 화학이 높은 glycosylated의 회복을 비효율적이라는 것입니다 가장 중요한 그 중 몇 가지 제한 사항을 가진 것으로 나타났습니다단백질. 하류 진단이 glycosylated 단백질을 대상으로하는 경우에이 시스템 식별에 적합하지 않을 수 있습니다. 또한 핵산이나 단백질 중 하나에 대한 추출 효율의 위턱과 아래턱에 제한은 아직 결정 및 최적화가 복구 효율성을 최대화하기 위해 진행하고있다. 도구의 발전이 현재의 지식 격차를 극복합니다.
The authors have nothing to disclose.
추출 피펫의 발전을위한 기금은 DRP에게 수여 내부 연구 및 개발 보조금에 의해 일부로 제공되었다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Guanidine Thiocyanate | Teknova | G4000 |
ethanol | Pharmco-Aaper | 11ACS200 |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 109827-1L |
BSA | Sigma | A-4503 |