Criblage à haut débit pour les petites molécules modulateurs de canaux potassiques entrants Rectifier
Summary
Méthodes d'élaboration et de validation d'un dosage quantitatif de fluorescence pour mesurer l'activité de potassium redresseur actif (Kir) des canaux pour le criblage de composés à haut débit est présenté.
Abstract
Certains membres de la famille redresseur canal potassique vers l'intérieur (Kir) sont postulés cibles thérapeutiques pour une variété de troubles, y compris l'hypertension, la fibrillation auriculaire, et de 1,2 douleur. Pour la plupart, toutefois, les progrès vers la compréhension de leur potentiel thérapeutique, voire fonctions physiologiques a été ralentie par le manque de bons outils pharmacologiques. En effet, la pharmacologie moléculaire de la famille redresseur entrant est restée loin derrière celle de la superfamille S4 de potassium voltage-dépendants (Kv), les canaux pour lesquels un certain nombre d'affinité nanomolaire et très modulateurs sélectifs des toxines peptidiques ont été découverts 3. La toxine du venin d'abeille tertiapin et ses dérivés sont de puissants inhibiteurs de Kir1.1 et Kir3 canaux 4,5, mais peptides sont d'une utilité limitée thérapeutique ainsi que expérimentalement en raison de leurs propriétés antigéniques et la biodisponibilité médiocre, la stabilité métabolique et la pénétrance des tissus. Le développement de puissantset sélectifs de petites molécules sondes avec des propriétés pharmacologiques améliorées sera un élément clé pour bien comprendre la physiologie et le potentiel thérapeutique des canaux Kir.
La moléculaire bibliothèques Sondes de production Network Center (MLPCN) supportée par le National Institutes of Health (NIH) Fonds commun a créé des opportunités pour les scientifiques académiques pour initier des campagnes de sonde de découverte de cibles moléculaires et les voies de signalisation dans le besoin d'une meilleure pharmacologie 6. L'offre aux chercheurs l'accès MLPCN aux centres de dépistage l'échelle industrielle et la chimie médicinale et de l'informatique en charge de développer de petites molécules sondes pour élucider la fonction des gènes et des réseaux de gènes. L'étape critique pour gagner l'entrée à l'MLPCN est le développement d'un test robuste cible ou une voie spécifique qui est susceptible de criblage à haut débit (HTS).
Ici, nous décrivons comment développer une base de fluorescence thallium (Tl +) flux assaY sur Kir canal de fonction pour le criblage à haut débit composé 7,8,9,10. L'essai est basé sur la perméabilité de la chaîne K + pores de la Tl + K + congénère. Un disponibles dans le commerce fluorescent Tl + colorant reporter est utilisé pour détecter le flux transmembranaire de Tl + à travers le pore. Il ya au moins trois colorants disponibles dans le commerce qui sont appropriés pour Tl + tests de flux: BTC, FluoZin-2, 7,8 et Fluxor. Ce protocole décrit le développement de tests à l'aide FluoZin-2. Bien qu'à l'origine développés et commercialisés comme un indicateur de zinc, FluoZin-2 présente une augmentation forte et dose-dépendante de l'émission de fluorescence lors de Tl + contraignant. Nous avons commencé à travailler avec FluoZin-2 avant Fluxor était disponible 7,8 et ont continué à le faire 9,10. Cependant, les étapes de développement de tests sont essentiellement identiques pour les trois colorants, et les utilisateurs devraient déterminer quels colorant est le plus approprié pour leur propre needs. Nous discutons également des critères de performance de l'analyse qui doit être atteint à prendre en considération pour l'entrée à l'MLPCN. Depuis Tl + imprègne facilement la plupart des canaux K +, le dosage doit être adapté à la plupart des objectifs de canaux K +.
Protocol
Representative Results
Discussion
Traitement des données: Une fois les données recueillies, une étape commune dans l'analyse consiste à normaliser réponse de fluorescence de chaque puits, F, à sa valeur initiale au début de l'expérience, F 0. Ceci est communément appelé le "rapport statique» et symbolisé "F / F 0". Dans le cas où F 0 est dominé par le colorant indicateur du fonctionnement rapport statique pour corriger sensiblement nombreux facteurs tels qu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par un financement du National Institutes of Health des subventions 1R21NS073097-01 et 1R01DK082884 (JSD) et la Fondation pour la PIER11VCTR instituts nationaux de subvention.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| pcDNA5/TO | Invitrogen | V1033-20 | Tetracycline-inducible expression vector |
| T-REx-HEK293 cells | Invitrogen | R71007 | Tetracycline-inducible cell line |
| Lipofectamine LTX/Plus Reagent | Invitrogen | 15338100 | Transfection reagent |
| FBS | ATLANTA Biologicals | S11550 | Cell culture media |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | Cell culture media |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | Cell culture media |
| Blasticidin S | Invitrogen | R210-01 | Cell culture media |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | Cell culture media |
| HBSS-divalent free | Mediatech | 21022CV | Cell washing |
| Trypsin-0.25% | Mediatech | 25053CI | Cell dissociation |
| Tetracycline-HCl | Sigma | T9823 | Induction reagent |
| Dialyzed FBS | ATLANTA Biologicals | S12650 | Plating media |
| FluoZin-2 | Invitrogen | F24189 | Fluorescent dye |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P-3000MP | Dye loading |
| HBSS | Invitrogen | 14175 | Assay buffer |
| HEPES | Invitrogen | 15630 | Assay buffer |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Tl+ stimulus buffer |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | Tl+ stimulus buffer |
| CaSO4•2H2O | Sigma | C3771 | Tl+ stimulus buffer |
| D-Glucose | Sigma | G7528 | Tl+ stimulus buffer |
| Thallium sulfate | Aldrich | 204625 | Tl+ stimulus buffer |
| HEPES | Sigma | H4034 | Tl+ stimulus buffer |
| DMSO | Sigma | D4540 | Solvent |
| Eight-channel electronic pipettor | Biohit | E300 | Cell plating in 384-well plates |
| BD PureCoat amine-coated 384-well plates | BD Biosciences | 356719 | Assay microplates |
| Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP) | Labcyte | P-05525 | Compound source microplates |
| 384-well polypropylene microplates | Greiner Bio-One | 781280 | |
| Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| ELx405 microplate washer | BioTek | ELx405HT | Automated cell washing |
| Echo liquid handler | Labcyte | Labcyte Echo 550 | |
| Bravo automated liquid handling platform | Agilent Technologies | Standard model | |
| Hamamatsu FDSS 6000 | Hamamatsu | Kinetic imaging plate reader |
Table 1. List of Materials and Reagents.
References
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