High-throughput screening para pequenas moléculas Moduladores de canais de potássio Interiores retificador

Summary

Os métodos para o desenvolvimento e validação de um ensaio quantitativo de fluorescência para medir a actividade de potássio rectificador de entrada (Kir) canais de rastreio de alto rendimento composto é apresentado.

Abstract

Membros específicos da família retificador de potássio para o interior do canal (Kir) são postuladas alvos terapêuticos para uma variedade de doenças, incluindo a hipertensão, a fibrilação atrial, e de ^1,2 a dor. Para a maior parte, no entanto, os avanços na compreensão do seu potencial terapêutico, ou mesmo funções fisiológicas básicas foi retardado pela falta de boas ferramentas farmacológicas. Na verdade, a farmacologia molecular da família rectificador de entrada tem ficado muito aquém do da superfamília S4 de potássio dependentes da voltagem (Kv) canais, para o qual um número de afinidade nanomolar e moduladores de toxinas peptídicas altamente selectivos foram descobertos ^3. A toxina de veneno de abelha tertiapin e seus derivados são inibidores potentes da Kir1.1 Kir3 e canais de ^4,5, mas os péptidos são de uso limitado terapeuticamente bem como experimentalmente devido às suas propriedades antigénicas e de biodisponibilidade pobre, a estabilidade metabólica e a penetrância do tecido. O desenvolvimento de potentese selectivos de pequenas moléculas sondas com propriedades farmacológicas melhoradas será a chave para a plena compreensão da fisiologia e potencial terapêutico de canais Kir.

O Molecular Libraries Sondas de Produção Centro de Rede (MLPCN), apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) Fundo Comum criou oportunidades para os cientistas acadêmicos para iniciar campanhas de sonda de detecção de alvos moleculares e vias de sinalização que necessitam de melhor farmacologia ^6. O MLPCN fornece aos pesquisadores acesso aos centros de indústria em escala de triagem e química medicinal e informática de apoio para desenvolver moléculas pequenas sondas para elucidar a função dos genes e redes de genes. O passo crítico para a admissão ao MLPCN é o desenvolvimento de um ensaio de meta-ou via específica robusto que é tratável através de rastreio de alto rendimento (HTS).

Aqui, descrevemos como desenvolver uma fluorescência baseada em tálio (Tl ⁺⁾ fluxo assay de Kir função do canal de rastreio de alto rendimento composto ^7,8,9,10. O ensaio é baseado sobre a permeabilidade do canal de K ⁺ de poro para o composto aparentado ⁺ K ⁺ Tl. A comercialmente disponível fluorescente Tl ⁺ corante repórter é utilizado para detectar o fluxo transmembranar de Tl ⁺ através do poro. Existem pelo menos três corantes disponíveis comercialmente que são adequados para os ensaios de fluxo de Tl ^+: BTC, FluoZin-2, e FluxOR ^7,8. Este protocolo descreve o desenvolvimento do ensaio usando FluoZin-2. Embora originalmente desenvolvidos e comercializados como um indicador de zinco, FluoZin-2 apresenta um aumento robusto e dose-dependente, na emissão de fluorescência após a ligação Tl ^+. Começamos a trabalhar com FluoZin-2 antes FluxOR estava disponível ^7,8 e continuaram a fazê-lo ^9,10. No entanto, os passos no desenvolvimento do ensaio são essencialmente idênticas para todas as três corantes, e os utilizadores devem determinar quais corante é mais apropriada para o seu n específicoeeds. Discutimos, também, referência do ensaio de desempenho que devem ser alcançados a ser considerado para a entrada no MLPCN. Desde Tl ⁺ facilmente permeia a maioria dos canais de K ^+, o ensaio deve ser adaptável para a maioria dos objectivos de K ⁺ channel.

Protocol

1. A geração de linhas celulares estáveis ​​policlonais O estabelecimento de uma linha de células de alta qualidade estável expressando o canal Kir de interesse é um primeiro passo importante para o desenvolvimento de um ensaio de rastreio de alto rendimento robusto. Constitutivo K + superexpressão do canal pode conduzir a activação de vias de morte celular, degeneração linha estável de células e perda de desempenho do ensaio. Para evitar estes problemas potenciais e proporcionar u…

Representative Results

A utilização de um sistema de expressão induzível por tetraciclina fornece um controle interno conveniente para distinguir Tl + fluxo através de vias endógenos e do canal Kir de interesse. Figura 1 mostra alguns exemplos de mapas de células de revestimento utilizados em diferentes tipos de ensaios. As posições dos poços que contêm as células não induzidas ou induzida por tetraciclina são indicados com cores diferentes. Figura 2A mostra o mapa da placa de base ut…

Discussion

Tratamento de dados: Uma vez que os dados são recolhidos, um passo comum na análise envolve a normalizar resposta da fluorescência de cada poço, F, ao seu valor inicial no início da experiência, F _0. Isto é vulgarmente referido como o "índice estático" e simbolizado "F / F ^_0". Nos casos em que F ₀ é dominado pelo corante indicador de operação estática proporção substancialmente corrigir por muitos factores tais como desunifor…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
pcDNA5/TO	Invitrogen	V1033-20	Tetracycline-inducible expression vector
T-REx-HEK293 cells	Invitrogen	R71007	Tetracycline-inducible cell line
Lipofectamine LTX/Plus Reagent	Invitrogen	15338100	Transfection reagent
FBS	ATLANTA Biologicals	S11550	Cell culture media
DMEM	Invitrogen	11965	Cell culture media
Hygromycin B	Invitrogen	10687-010	Cell culture media
Blasticidin S	Invitrogen	R210-01	Cell culture media
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140	Cell culture media
HBSS-divalent free	Mediatech	21022CV	Cell washing
Trypsin-0.25%	Mediatech	25053CI	Cell dissociation
Tetracycline-HCl	Sigma	T9823	Induction reagent
Dialyzed FBS	ATLANTA Biologicals	S12650	Plating media
FluoZin-2	Invitrogen	F24189	Fluorescent dye
Pluronic F-127	Invitrogen	P-3000MP	Dye loading
HBSS	Invitrogen	14175	Assay buffer
HEPES	Invitrogen	15630	Assay buffer
NaHCO3	Sigma	S6297	Tl+ stimulus buffer
MgSO4	Sigma	M2643	Tl+ stimulus buffer
CaSO4•2H2O	Sigma	C3771	Tl+ stimulus buffer
D-Glucose	Sigma	G7528	Tl+ stimulus buffer
Thallium sulfate	Aldrich	204625	Tl+ stimulus buffer
HEPES	Sigma	H4034	Tl+ stimulus buffer
DMSO	Sigma	D4540	Solvent
Eight-channel electronic pipettor	Biohit	E300	Cell plating in 384-well plates
BD PureCoat amine-coated 384-well plates	BD Biosciences	356719	Assay microplates
Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP)	Labcyte	P-05525	Compound source microplates
384-well polypropylene microplates	Greiner Bio-One	781280
Multidrop Combi reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300
ELx405 microplate washer	BioTek	ELx405HT	Automated cell washing
Echo liquid handler	Labcyte	Labcyte Echo 550
Bravo automated liquid handling platform	Agilent Technologies	Standard model
Hamamatsu FDSS 6000	Hamamatsu		Kinetic imaging plate reader

Table 1. List of Materials and Reagents.