Compact Quantum Dots für Einzelmolekül-Imaging
Summary
Wir beschreiben die Herstellung von kolloidalen Quantenpunkten mit minimierter hydrodynamische Größe für Einzel-Molekül-Fluoreszenz-Imaging. Im Vergleich zu herkömmlichen Quantenpunkte sind diese Nanopartikel in der Größe ähnlich zu globularen Proteinen und sind für Einzel-Molekül-Helligkeit, Stabilität gegen Photodegradation und Beständigkeit gegen unspezifische Bindung an Proteine und Zellen optimiert.
Abstract
Single-Molecule Imaging ist ein wichtiges Instrument für das Verständnis der Mechanismen der biomolekularen Funktion und zur Visualisierung der räumlichen und zeitlichen Heterogenität der molekularen Verhaltensweisen, die Zellbiologie 1-4 zugrunde liegen. Zum Abbilden eines einzelnen Moleküls von Interesse, ist es typischerweise konjugiert an einen fluoreszierenden Marker (Farbstoff, Protein, Kügelchen oder Quantenpunkt) und beobachtet mit Epifluoreszenz oder Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF)-Mikroskopie. Während Farbstoffe und fluoreszierende Proteine gewesen die Hauptstütze der Fluoreszenz-Bildgebung Jahrzehnten ist ihre Fluoreszenz unter hohem Photonenflüsse notwendig, einzelne Moleküle zu beobachten instabil, was nur wenige Sekunden der Beobachtung vor dem vollständigen Verlust des Signals. Latexkügelchen und Farbstoff-markierten Kügelchen eine verbesserte Signalstabilität aber auf Kosten drastisch größere hydrodynamische Größe, die nachteilig zu verändern, kann die Diffusion und das Verhalten des untersuchten Moleküls.
ntent "> Quantum Dots (QDs) bieten eine Balance zwischen diesen beiden problematischen Regime. Diese Nanopartikel aus Halbleitermaterialien bestehen und kann mit einem hydrodynamisch kompakte Größe mit außergewöhnlicher Beständigkeit gegen Photodegradation 5 konstruiert werden. So ist in den letzten Jahren QDs wurden in ermöglicht instrumental Langzeitbeobachtung von komplexen makromolekularen Verhalten auf der Ebene einzelner Moleküle. Allerdings sind diese Teilchen noch gefunden zu einer Beeinträchtigung der Diffusion in überfüllten molekularen Umgebungen wie dem Zytoplasma und der neuronalen synaptischen Spalt, wo ihre Größen sind immer noch zu groß 4,6 aufweisen , 7.Vor kurzem haben wir die Kerne und Oberflächenbeschichtungen von QDs für minimierte hydrodynamischen Größe ausgelegt, während Balancing Offsets kolloidalen Stabilität, Photostabilität, Helligkeit und unspezifische Bindung, die den Nutzen der kompakten QDs behindert haben in der Vergangenheit 8,9. Das Ziel dieses Artikels ist es zu zeigendie Synthese, Modifizierung und Charakterisierung dieser optimierten Nanokristalle aus einem legierten Hg x Cd 1-x Se-Kern mit einer isolierenden Cd y Zn 1-y S Schale, weiter mit einem mehrzähnigen Liganden mit kurzer Polymer Polyethylenglykol modifiziert beschichtet ist ( PEG)-Ketten (Abbildung 1). Verglichen mit herkömmlichen CdSe-Nanokristalle, bieten Hg x Cd 1-x Se-Legierungen größer Quantenausbeuten der Fluoreszenz Fluoreszenz bei rotem und nahes Infrarot-Wellenlängen für verbessertes Signal-zu-Rauschen in Zellen, und Anregung bei nicht zytotoxische sichtbaren Wellenlängen. Mehrzähnigen Polymerbeschichtungen binden an den Nanokristalloberfläche in einem geschlossenen und flache Konformation hydrodynamischen Größe zu minimieren, und PEG neutralisiert die Oberflächenladung auf unspezifische Bindung an Zellen und Biomolekülen zu minimieren. Das Ergebnis ist ein hell fluoreszierende Nanokristall mit Emission zwischen 550-800 nm und insgesamt hydrodynamische Größe der Nähe von 12 nm. Dies ist in der same Größenbereich so viele lösliche globuläre Proteine in Zellen, und wesentlich kleiner als bei konventionellen PEGylierte QDs (25-35 nm).
Protocol
Representative Results
Discussion
Im Vergleich zu herkömmlichen CdSe Quantenpunkten, können ternäre Legierung Hg x Cd 1-x Se-Nanokristalle in der Größe und Fluoreszenzwellenlänge unabhängig eingestellt werden. Die Größe wird zuerst während der Synthese von CdSe Nanokristall Kernen ausgewählt und der Fluoreszenzwellenlänge in einem sekundären Quecksilber Kationenaustauschschritt, welche im Wesentlichen nicht verändern die Nanokristallgröße 9 übernommen. Es ist wichtig, damit das gereinigte Hg x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Dr. Hong Yi an der Emory University Integrierte Microscopy Core-danke für die Elektronenmikroskopie Bildgebung. Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse finanziert (PN2EY018244, R01 CA108468, U54CA119338 und 1K99CA154006-01).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865 | |
| Tri-n-octylphosphine | Strem | 15-6655 | 97% pure, unstable in air |
| Cadmium oxide | Sigma-Aldrich | 202894 | Highly toxic: use caution |
| Tetradecylphosphonic acid | PCI Synthesis | 4671-75-4 | |
| Octadecene | Alfa Aesar | L11004 | Technical grade |
| Hexadecylamine | Sigma-Aldrich | H7408 | |
| Diphenylphosphine | Sigma-Aldrich | 252964 | Pyrophoric |
| Mercury acetate | Sigma-Aldrich | 456012 | Highly toxic: use caution |
| 1-Octanethiol | Sigma-Aldrich | 471836 | Strong odor |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | W281506 | |
| Zinc acetate | Alfa Aesar | 35792 | |
| Cadmium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 229490 | Highly toxic: use caution |
| Oleylamine | Fisher Scientific | AC12954 | Unstable in air |
| Sulfur | Sigma-Aldrich | 344621 | |
| Trioctylphosphine oxide | Strem | 15-6661 | 99% |
| Pyridine | VWR | EM-PX2012-6 | Anhydrous |
| Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753 | Strong odor |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283 | Anhydrous |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 131342 | 20 kDa cutoff |
| Centrifugal filter | Millipore | UFC801024 | 10 kDa cutoff |
| Monoamino-PEG | Rapp Polymere | 12 750-2 | 750 Da |
| DMTMM, 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride hydrate | Alfa Aesar | H26333 | |
| AKTAprime Plus Chromatography System | GE HealthCare | ||
| Superose 6 10/300 GL chromatography column | GE HealthCare | 17-5172-01 | |
| Agarose, OmniPur | VWR | EM-2120 | |
Appendix Synthesis of mercury octanethiolate: Slowly add a methanol solution of mercury acetate (1 eq.) to a stirring solution of 1-octanethiol (3 eq.) and potassium hydroxide (3 eq.) in methanol at room temperature. Isolate the mercury(II) octanethiolate precipitate via filtration, wash two times with methanol and once with ether, and then dry under vacuum. Synthesis of multidentate polymer: Dissolve polyacrylic acid (1 g, 1,773 Da) in 25 ml dimethylformamide (DMF) in a 150 ml three-necked flask and bubble with argon for 30 min. Add an anhydrous solution of cysteamine (374 mg, 4.87 mmol) in 10 ml DMF. At room temperature with vigorous stirring, slowly add anhydrous diisopropylcarbodiimide (DIC, 736 mg, 5.83 mmol) over 30 min, followed by triethylamine (170 μl, 1.22 mmol), and allow the reaction to proceed for 72 hr at 60 °C. Add mercaptoethanol (501 mg, 6.41 mmol) to quench the reaction, and stir for 2 hr at room temperature. Remove DMF via rotary evaporation and isolate the polymer with the addition of a 2:1 mixture of ice-cold acetone:chloroform, followed by centrifugation. Dissolve the polymer in ~5 ml anhydrous DMF, filter, precipitate again with diethyl ether, and repeat. Dry the product under vacuum and store under argon. Determination of CdSe core diameter: From the UV-Vis absorption spectrum determine the wavelength of the first exciton peak (λ, in nm), which is the longest-wavelength peak (e.g. roughly 498 nm for CdSe in Figure 2a), and use the sizing curve of Mulvaney and coworkers 12:
Determination of CdSe nanocrystal concentration: From a background-subtracted UV-Vis spectrum of an optically clear solution of CdSe nanocrystals, determine the absorption at 350 nm wavelength. Serial dilutions can be used to determine if the optical absorption is within the linear range of Beer’s Law. The nanocrystal concentration (QD, in M) can be determined by plugging in the nanocrystal diameter (D, in nm), the optical absorption value (A3sa), and the cuvette path length (l, in cm) into the following equation from the empirical correlation of Bawendi and coworkers 13:
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