El estudio de la proteólisis de ciclina B en el nivel de células individuales en poblaciones de células enteras
Summary
Metafase anafase transición se activa a través de la promoción de complejos anafase (APC / C)-dependiente de ubiquitinación y posterior destrucción de la ciclina B. En este caso, hemos establecido un sistema que, a raíz de pulso-caza etiquetado, permite monitorizar la proteólisis de ciclina B en poblaciones de células enteras y facilita la detección de interferencia por el puesto de control mitótico.
Abstract
Distribución equitativa de los cromosomas entre las dos células hijas durante la división celular es un requisito previo para garantizar la estabilidad genética 1. Imprecisiones en la separación de los cromosomas son una característica de malignidad y asociado con la enfermedad progresiva 2-4. El punto de control de ensamblaje del huso (SAC) es un mecanismo de vigilancia mitótico que retiene las células en metafase hasta que cada cromosoma individual ha establecido una unión bipolar estable para el huso mitótico 1. El SAC ejerce su función por la interferencia con la activación de APC / C subunidad Cdc20 para bloquear la proteolisis de securin y ciclina B y así separación de los cromosomas y la salida de mitosis. Fijación incorrecta de cromosomas impide el silenciamiento de SAC señalización y provoca la inhibición continuada de APC / C Cdc20 hasta que se resuelva el problema para evitar missegregation cromosómica, aneuploidía y tumores malignos 1.
La mayoría de los estudios que abordaron la influence de apego indebido cromosómico en APC / C dependiente de proteólisis aprovechó la interrupción del husillo mediante despolimerización de microtúbulos o la estabilización de los medicamentos para interferir con apego a los microtúbulos cromosómicos. Dado que la interferencia con la cinética de microtúbulos pueden afectar el transporte y localización de reguladores críticos, estos procedimientos llevan un riesgo de inducir efectos artificiales 5.
Para estudiar cómo el SAC interfiere con la APC / C dependiente de proteólisis de ciclina B durante la mitosis en las poblaciones de células imperturbable, hemos establecido un sistema de histonas H2-GFP-base que permitió la monitorización simultánea de la alineación de los cromosomas en metafase mitótica y la proteólisis de la ciclina B 6 .
Para describir perfiles proteolíticos, hemos generado una ciclina B quimérico molécula indicadora con un resto C-terminal de SNAP 6 (Figura 1). En una reacción de auto-etiquetado, la SNAP-resto es capaz de formar enlaces covalentes conalkylguanine-portadoras (sustrato SNAP) 7,8 (Figura 1). Moléculas de sustrato SNAP son fácilmente disponibles y llevar a un amplio espectro de diferentes fluorocromos. Quiméricos ciclina B-SNAP moléculas se vuelven marcado después de la adición del sustrato de SNAP-membrana permeable al medio de crecimiento 7 (Figura 1). Después de la reacción de marcaje, la intensidad de la ciclina B-SNAP fluorescencia cae en una reacción de tipo de pulso y persecución manera y las intensidades de fluorescencia reflejan los niveles de ciclina B degradación 6 (Figura 1). Nuestro sistema facilita el seguimiento de mitótico APC / C dependiente de la proteolisis en un gran número de células (o varias poblaciones de células) en paralelo. De esta manera, el sistema puede ser una herramienta valiosa para identificar agentes / moléculas pequeñas que son capaces de interferir con la actividad proteolítica en la metafase a anafase de transición. Además, como la síntesis de la ciclina B durante la mitosis Recientemente se ha sugerido como un mecanicista importantesm en el fomento de un bloque mitótico en ratones y seres humanos al mantener los niveles de ciclina expresión B 9,10 estables, este sistema nos ha permitido analizar la proteólisis de ciclina B como un elemento de un equilibrio satisfactorio 6.
Protocol
Discussion
Presentamos aquí un enfoque de células vivas imágenes basada en facilitar el seguimiento simultáneo de la ciclina B proteólisis y la alineación de los cromosomas. Este enfoque permite el estudio del control mitótico en imperturbable poblaciones de células en el nivel de célula única. Ciclina B curvas de degradación de facilitar conocimientos directos en la actividad de la APC / C y así indirectamente reflejan el estado de la SAC 6.
Este enfoque, aunque establece en bas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a S. Taylor para la prestación del pLPCX-Histone H2-GFP plásmido. Damos las gracias a R. Mertelsmann apoyo continuo. Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft.
Materials
| Name of product | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Reporter cell line | generated in-house as described 6 | clone 11 reporter cells (U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells) |
|
| Retroviral cyclin B-SNAP expression vector | generated in-house as described 6 | pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP | |
| Phenolred-free DMEM | Gibco | 21063-029 | Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required |
| SNAP-Cell TMR-Star | New England Biolabs | S9105S | Stock solution 400 μM in DMSO |
| Special Opstics Plate, 96 well | Costar | 3720 | |
| μ-Slide 8 well, ibiTreat | Ibidi | 80826 | |
| Microscopy unit | Olympus | IX-81 inverse microscope with climate chamber | |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75) | |
| Acquisition software | Olympus | Scan^R Acquisition software (v.2.2.09) | |
| Analysis software | Olympus | Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6) |
References
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