Tüm Cep Populasyonlarının Tek Hücre Düzeyinde Siklin B Proteoliz incelenmesi
Summary
Geçiş anafaz-teşvik kompleksi (APC / C)-bağımlı ubikuitinasyon ve burada siklin B. sonraki yıkım, biz, darbe-kovalamaca etiketleme sonrasında, bir sistem kurulmuş tüm hücre popülasyonlarında siklin B proteoliz izleme sağlar ve tetiklenir anafaz için metafaz mitotik geçiş noktasından müdahale tespitini kolaylaştırır.
Abstract
Hücre bölünmesi sırasında iki yavru hücre arasında kromozomların eşit dağılımı genetik değişmezlik 1 garanti için bir ön koşuldur. Kromozom ayrılması sırasında yanlışlıklar malignite bir işaretidir ve ilerleyici bir hastalık 2-4 ile ilişkilidir. Mili montaj noktası (SAC) her kromozom mitotik iğ 1. istikrarlı bir bipolar eki kurmuştur kadar geri metafaz hücrelere tutan bir mitoz gözetim mekanizmadır. SAC aktive müdahale ederek işlevini uygular APC / C securin ve siklin B proteoliz ve böylece kromozom ayırma ve mitotik çıkış engellemek için subunit Cdc20. Kromozomların yanlış eki SAC sinyalizasyon susturulmalarını engeller ve problemi kromozom missegregation, anöploidi ve malign büyümeleri 1 önlemek için çözülünceye kadar APC / C Cdc20 arasında devam inhibisyonu neden olur.
I ele çalışmaların çoğuAPC / C-bağımlı proteoliz üzerine uygunsuz kromozomal eki nfluence mikrotübüle kromozomal eki ile etkileşime ilaçlar depolimerizasyon veya mikrotübül-dengeleyici kullanarak mili bozulması yararlandı. Mikrotübül kinetiği müdahale ulaşım ve kritik düzenleyiciler lokalizasyonu etkileyebileceğinden, bu prosedürler suni etkileri 5 inducing bir risk taşıyor.
SAC mitoz sırasında APC / siklin B C-bağımlı proteoliz müdahale nasıl çalışma için hücre popülasyonlarının soğukkanlı, biz izin bir histon H2-GFP-tabanlı sistem kurulmuş metafaz mitotik kromozom uyumuna ve siklin B 6 proteolizin eşzamanlı izleme .
Proteolitik profilleri tasvir etmek için, bir C-terminal parçası SNAP 6 (Şekil 1) ile bir kimerik siklin B raportör molekül üretilir. Kendi kendine etiketleme reaksiyonunda, SNAP-parçası ile kovalent bağ oluşturabilenalkylguanine taşıyıcılar (SNAP substrat) 7,8 (Şekil 1). SNAP yüzey molekülleri kolayca kullanılabilir ve değişik florokromlar geniş bir yelpaze taşırlar. Kimerik siklin B-SNAP molekülleri büyüme ortamı 7 (Şekil 1) zar-SNAP geçirgen alt tabakanın ilavesinden sonra etiketli hale gelir. Etiketleme reaksiyondan sonra, siklin B-SNAP floresans şiddetinin bir darbe-kovalamaca reaksiyon benzeri şekilde ve floresan yoğunlukları siklin B bozulması 6 (Şekil 1) düzeylerini yansıtacak düşer. Bizim sisteme paralel hücreleri (veya birkaç hücre popülasyonlarının) çok sayıda mitotik APC / C bağımlı proteolizin izlenmesini kolaylaştırır. Böylece, sistem aracıları / geçiş anafaz için metafaz de proteolitik aktiviteyi bozar edebiliyoruz küçük moleküller belirlemek için değerli bir araç olabilir. Ayrıca, mitoz sırasında siklin B sentezi gibi son zamanlarda önemli bir mechanis olarak öne sürülmüştürstabil siklin B ekspresyon düzeyleri 9,10 tutarak farelerde ve insanlarda bir mitoz blok teşvik m, bu sistem bize dengeli bir denge 6 bir unsuru olarak siklin B proteoliz analiz sağladı.
Protocol
Discussion
Biz burada siklin B proteoliz ve kromozom uyum eşzamanlı izleme kolaylaştıran bir canlı hücre görüntüleme tabanlı bir yaklaşım sunuyoruz. Bu yaklaşım mitotik kontrol çalışması tek hücre düzeyinde hücre popülasyonu soğukkanlı sağlar. Siklin B degradasyon eğrileri APC / C aktivitesini doğrudan içten kolaylaştırmak ve böylece dolaylı SAC 6 durumunu yansıtmaktadır.
Bu yaklaşım, olsa Tarama ^ R yazılım dayalı kurulan, kolayca herhangi bir karşıl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz pLPCX-Histon H2-GFP plazmid sağlamak için S. Taylor minnettarız. Biz sürekli destek için R. Mertelsmann ederim. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of product | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Reporter cell line | generated in-house as described 6 | clone 11 reporter cells (U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells) |
|
| Retroviral cyclin B-SNAP expression vector | generated in-house as described 6 | pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP | |
| Phenolred-free DMEM | Gibco | 21063-029 | Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required |
| SNAP-Cell TMR-Star | New England Biolabs | S9105S | Stock solution 400 μM in DMSO |
| Special Opstics Plate, 96 well | Costar | 3720 | |
| μ-Slide 8 well, ibiTreat | Ibidi | 80826 | |
| Microscopy unit | Olympus | IX-81 inverse microscope with climate chamber | |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75) | |
| Acquisition software | Olympus | Scan^R Acquisition software (v.2.2.09) | |
| Analysis software | Olympus | Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6) |
References
- Musacchio, A., Salmon, E. D. The spindle-assembly checkpoint in space and time. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).
- Nasmyth, K. Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation. Science. 297, 559-565 (2002).
- Cahill, D. P. Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers. Nature. 392, 300-303 (1998).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instabilities in human cancers. Nature. 396, 643-649 (1998).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-4892 (2010).
- Schnerch, D. Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations. Cell Cycle. 11, (2012).
- Keppler, A. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).
- Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).
- Malureanu, L. Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis. J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).
- Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1. PLoS One. 5, (2010).
- Wolthuis, R. Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin. A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).
