血漿タンパク保存用採血キットからゲノムDNAを抽出するために実用的で新手法
Summary
私たちは、血漿/血清学的検査のために採取した全血からゲノムDNAを単離する新たな方法を説明しています。血漿採取した後、圧縮された血液は、通常廃棄されます。当社の新規の方法は、既存の方法に比べて大幅な改善を表し、追加の血液を要求せず、単一のコレクションからのDNAやプラズマを利用できるようになります。
Abstract
臨床検査は、血液の細胞または流体部分に行うことができる。別の採血管を使用することにより分析することができる血液（全血、血漿または血清）の一部を決定する。人間の疾患の遺伝的基礎を研究に携わる研究所は、ゲノム/遺伝子解析のためのDNAの供給源としてEDTA含有バキュテナーに収集凝固処理全血に依存しています。ほとんどの臨床検査室は、表現型のアウトカム調査の最初のステップとして、生化学的、血清学的およびウイルスのテストを実行するため、抗凝固処理血液もヘパリン含有チューブ（プラズマチューブ）に集められる。したがってDNAプラズマがゲノムおよびプロテオミクスデータの両方の同時並列分析のために必要とされる場合には、EDTAおよびヘパリンチューブの両方に血液を採取するのが通例である。血液は単一の管に収集し、血漿とDNAの両方の原因となることができれば、その方法は、既存のメタへ前進であると考えられるODS。プラズマ抽出後の圧縮された血液の使用は、このように処理された血液試料の量を最小化し、各患者から必要なサンプル数を減らすこと、ゲノムDNAの代替供給源を表す。これは、最終的に時間とリソースを節約できるでしょう。
血漿タンパク質保存用BD P100血液採取システムは、ヒト血液から良好なタンパク質バイオマーカーの発見およびプロテオミクス実験を可能にし、血液のタンパク質含有量を安定させるために、前の血漿または血清採血管1よりも改善された方法として作成された。 BD P100管は、15.8、噴霧乾燥K2EDTA mlの凝固を防止し、血漿タンパク質を安定化するプロテアーゼ阻害剤の凍結乾燥された独自の広域スペクトルカクテルを含有する。また、遠心分離後、血漿および細胞ペレット間の物理的障壁を提供する機械的なセパレータを含む。いくつかの方法は、凝固した血液のsaからDNAを抽出するために考案されているmples古いプラズマチューブ2-4に収集。これらのメソッドからの課題は、主にチューブ（ゲル·セパレータ）の内部セパレータの種類に関連付けられており、凝固した血液の回収が困難である、断片化や血栓を分散させるの不便さ、および分離ゲルによって血栓抽出の閉塞を含まれていた。
私たちは、新しいBD P100チューブに採取した血液からゲノムDNAを抽出し、浄化する最初の方法を提示する。私たちは、P100のチューブからEDTA管からそれにDNAサンプルの品質を比較。我々のアプローチは、シンプルかつ効率的である。 2）機械的なセパレータの除去は、スクロースとの組み合わせを使用して、採血のための機械的なセパレータをプラズマBD P100（BD診断、スパークス、MD、USA）管の1）を使用する：これは、次の4つの主な手順が含まれ無菌クリップ金属フック、3）及び4白血球を含むバフィーコート層の剥離）からのゲノムDNAの単離軟膜は、通常の商業的なDNA抽出キット又は類似の標準プロトコルを使用する。
Protocol
Representative Results
Discussion
多くの人間の病気は、遺伝的な原因があり、人間の病気の遺伝的基礎を探求することは増加高品質のDNAが求められます。遺伝学的研究に使用されるDNAの最も一般的な原因は、全血を抗凝固される。ほとんどの臨床検査室では、生化学的な血清学、および表現型アウトカム調査の最初のステップのようなウイルスのテストを実行するので、血液がしばしばプラズマチューブに集められる。血漿?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number |
| BD P100 tubes | BD Diagnostics | 366448 |
| EDTA tubes | BD Diagnostics | 367863 |
| Sucrose | Sigma | S9378 |
| Paper clip | Office product | |
| 15 ml tube | Corning | 430052 |
| Red blood cells (RBC) | Qiagen | 158389 (kit) |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Thermo Scientific | SH30256.01 |
| BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) | Qiagen | 940054 |
| 1.7 ml microtubes | Axygen | MCT-175-C |
| Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit | Illumina | WG-352-1001 |
| Bead array reader | Illumina | NA |
| GenomeStudio Software | Illumina | N/A |
References
- Yi, J., Kim, C., Gelfand, C. A. Inhibition of intrinsic proteolytic activities moderates preanalytical variability and instability of human plasma. Journal of Proteome Research. 6, 1768-1781 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clinical Chemistry. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clinical Chemistry. 44, 1748-1750 (1998).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Molecular Biotechnology. 46, 258-264 (2010).
- Cortes, A., Brown, M. A. Promise and pitfalls of the Immunochip. Arthritis Research & Therapy. 13, 101 (2011).
- Basuni, A. A., Butterworth, L. A., Cooksley, G., Locarnini, S., Carman, W. F. An efficient extraction method from blood clots for studies requiring both host and viral DNA. Journal of Viral Hepatitis. 7, 241-243 (2000).
- Kanai, N., Fujii, T., Saito, K., Tokoyama, T. Rapid and simple method for preparation of genomic DNA from easily obtainable clotted blood. Journal of Clinical Pathology. 47, 1043-1044 (1994).
- Adkins, K. K., Strom, D. A., Jacobson, T. E., Seemann, C. R., O’Brien, D. P., Heath, E. M. Utilizing genomic DNA purified from clotted blood samples for single nucleotide polymorphism genotyping. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 126, 266-270 (2002).
- Siafakas, N., Burnett, L., Bennetts, B., Proos, A. Nonenzymatic extraction of DNA from blood collected into serum separator tubes. Clinical Chemistry. 41, 1045-1046 (1995).
- Everson, R. B., Mass, M. J., Gallagher, J. E., Musser, C., Dalzell, J. Extraction of DNA from cryopreserved clotted human blood. BioTechniques. 15, 18-20 (1993).
- Se Fum Wong, S., Kuei, J. J., Prasad, N., Agonafer, E., Mendoza, G. A., Pemberton, T. J., Patel, P. I. A simple method for DNA isolation from clotted blood extricated rapidly from serum separator tubes. Clin. Chem. 53, 522-524 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clin. Chem. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clin. Chem. 44, 1748-1750 (1998).
- Matheson, L. A., Duong, T. T., Rosenberg, A. M., Yeung, R. S. Assessment of sample collection and storage methods for multicenter immunologic research in children. Journal of Immunological Methods. 339, 82-89 (2008).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Mol. Biotechnol. 46, 258-264 (2010).
- Polychronakos, C. Fine points in mapping autoimmunity. Nature. 43, 1173-1174 (2011).
- Cooper, J. D., Simmonds, M. J., Walker, N. M., Burren, O., Brand, O. J., Guo, H., Wallace, C., Stevens, H., Coleman, G., Franklyn, J. A., Todd, J. A., Gough, S. C. Seven newly identified loci for autoimmune thyroid disease. Human Molecular Genetics. , (2012).
