En praktisk og Novel metode for å utvinne genomisk DNA fra Blodprøverør Kits for Plasma Protein Preservation
Summary
Vi beskriver en ny metode for å isolere genomisk DNA fra blod samles for plasma / serologi. Etter plasma-samlingen, er den kompakterte blod vanligvis kassert. Vår nye fremgangsmåte representerer en betydelig forbedring i forhold til eksisterende metoder og gjør DNA tilgjengelig og plasma fra en enkelt kilde, uten å be om ytterligere blod.
Abstract
Laboratorieprøver kan gjøres på de cellulære eller væske partier av blod. Bruken av forskjellige blodprøverør bestemmer den del av blodet som kan analyseres (fullblod, plasma eller serum). Laboratorier involvert i å studere det genetiske grunnlaget for menneskelige lidelser stole på antikoagulert fullblod samlet i EDTA-holdig vacutainer som kilden til DNA for genetisk / genomisk analyse. Fordi de fleste kliniske laboratorier utføre biokjemiske, serologiske og viral testing som et første skritt i fenotypisk utfallet etterforskning, er antikoagulert blod også samlet i heparin-holdig tube (plasma tube). Derfor når DNA og plasma er nødvendig for samtidig og parallelt analyser av både genomisk og proteomikk data, er det vanlig å samle opp blod i både EDTA og heparin rør. Hvis blodet kan samles i et enkelt rør og tjener som en kilde for både plasma-og DNA, vil denne metoden anses en avansement til eksisterende methods. Bruken av den komprimerte blod plasma etter ekstraksjon representerer en alternativ kilde for genomisk DNA, og dermed minimere mengden av blod-prøver behandlet og redusere antall prøver kreves fra hver pasient. Dette vil til slutt spare tid og ressurser.
Den BD P100 blod innsamlingssystem for plasmaprotein bevaring ble laget som en forbedret fremgangsmåte i forhold til tidligere plasma eller serum samling rør 1, for å stabilisere proteininnholdet i blod, slik at bedre protein biomarkører og proteomforskning eksperimentering fra humant blod. BD P100 rørene inneholder 15,8 ml spray-tørket K2EDTA og frysetørret proprietær bredt spekter cocktail av proteasehemmere for å hindre koagulasjon og stabilisere plasmaproteiner. De kan også inkludere en mekanisk separator, som gir en fysisk barriere mellom plasma og celle-pellets etter sentrifugering. Noen metoder har blitt utviklet for å trekke ut DNA fra levret blod samples samlet i gamle plasma rør 2-4. Utfordringer fra disse metodene var i hovedsak knyttet til den type separator inne i rørene (gel separator) og inkludert problemer med å utvinne levret blod, det inntrufne av fragmentering eller spredning blodpropp, og obstruksjon av blodpropp utvinning av separasjon gel.
Vi presenterer den første metoden som trekker ut og renser genomisk DNA fra blod trekkes i de nye BD P100 rør. Vi sammenligne kvaliteten av DNA-prøven fra P100 rør som fra EDTA-rør. Vår tilnærming er enkel og effektiv. Det omfatter fire hovedtrinn som følger: 1) bruk av et plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) rør med mekanisk separator for blodprøvetaking, 2) fjerning av den mekaniske separatoren ved hjelp av en kombinasjon av sakkarose og et sterilt binders metallisk krok, 3) separasjon av de buffy coat laget som inneholder de hvite celler og 4) isolering av genomisk DNA fra denbuffycoat å bruke en vanlig kommersiell DNA-ekstraksjon kit eller en lignende standard protokoll.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mange menneskelige sykdommer har genetiske årsaker og utforske det genetiske grunnlaget for menneskelig sykdom krever en økende høy kvalitet DNA. Den vanligste kilde til DNA brukt i genetiske studier er antikoagulert fullblod. Fordi de fleste kliniske laboratorier utføre biokjemiske, serologiske, og viral testing som et første skritt i fenotypisk utfallet etterforskning, er blodet ofte samlet i en plasma tube. Etter samling av plasma, er den kompakterte blod ofte kastes. Derfor, når DNA er nødvendig for å utfør…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number |
| BD P100 tubes | BD Diagnostics | 366448 |
| EDTA tubes | BD Diagnostics | 367863 |
| Sucrose | Sigma | S9378 |
| Paper clip | Office product | |
| 15 ml tube | Corning | 430052 |
| Red blood cells (RBC) | Qiagen | 158389 (kit) |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Thermo Scientific | SH30256.01 |
| BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) | Qiagen | 940054 |
| 1.7 ml microtubes | Axygen | MCT-175-C |
| Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit | Illumina | WG-352-1001 |
| Bead array reader | Illumina | NA |
| GenomeStudio Software | Illumina | N/A |
References
- Yi, J., Kim, C., Gelfand, C. A. Inhibition of intrinsic proteolytic activities moderates preanalytical variability and instability of human plasma. Journal of Proteome Research. 6, 1768-1781 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clinical Chemistry. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clinical Chemistry. 44, 1748-1750 (1998).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Molecular Biotechnology. 46, 258-264 (2010).
- Cortes, A., Brown, M. A. Promise and pitfalls of the Immunochip. Arthritis Research & Therapy. 13, 101 (2011).
- Basuni, A. A., Butterworth, L. A., Cooksley, G., Locarnini, S., Carman, W. F. An efficient extraction method from blood clots for studies requiring both host and viral DNA. Journal of Viral Hepatitis. 7, 241-243 (2000).
- Kanai, N., Fujii, T., Saito, K., Tokoyama, T. Rapid and simple method for preparation of genomic DNA from easily obtainable clotted blood. Journal of Clinical Pathology. 47, 1043-1044 (1994).
- Adkins, K. K., Strom, D. A., Jacobson, T. E., Seemann, C. R., O’Brien, D. P., Heath, E. M. Utilizing genomic DNA purified from clotted blood samples for single nucleotide polymorphism genotyping. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 126, 266-270 (2002).
- Siafakas, N., Burnett, L., Bennetts, B., Proos, A. Nonenzymatic extraction of DNA from blood collected into serum separator tubes. Clinical Chemistry. 41, 1045-1046 (1995).
- Everson, R. B., Mass, M. J., Gallagher, J. E., Musser, C., Dalzell, J. Extraction of DNA from cryopreserved clotted human blood. BioTechniques. 15, 18-20 (1993).
- Se Fum Wong, S., Kuei, J. J., Prasad, N., Agonafer, E., Mendoza, G. A., Pemberton, T. J., Patel, P. I. A simple method for DNA isolation from clotted blood extricated rapidly from serum separator tubes. Clin. Chem. 53, 522-524 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clin. Chem. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clin. Chem. 44, 1748-1750 (1998).
- Matheson, L. A., Duong, T. T., Rosenberg, A. M., Yeung, R. S. Assessment of sample collection and storage methods for multicenter immunologic research in children. Journal of Immunological Methods. 339, 82-89 (2008).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Mol. Biotechnol. 46, 258-264 (2010).
- Polychronakos, C. Fine points in mapping autoimmunity. Nature. 43, 1173-1174 (2011).
- Cooper, J. D., Simmonds, M. J., Walker, N. M., Burren, O., Brand, O. J., Guo, H., Wallace, C., Stevens, H., Coleman, G., Franklyn, J. A., Todd, J. A., Gough, S. C. Seven newly identified loci for autoimmune thyroid disease. Human Molecular Genetics. , (2012).
