Iteratieve optimalisatie van DNA-duplexen voor kristallisatie van SeqA-DNA complexen

Summary

Kristalstructuur van eiwit-DNA-complexen kan inzicht verschaffen in eiwitfunctie, mechanisme, evenals de aard van de specifieke interactie. Hier rapporteren we hoe de lengte en sequentie uiteinden van duplex DNA optimaliseren voor co-kristallisatie met<em> Escherichia coli</em> SeqA, een negatieve regulator van replicatie-initiatie.

Abstract

Escherichia coli SeqA is een negatieve regulator van DNA replicatie die premature her-initiatie gebeurtenissen sequestering hemimethylated GATC clusters voorkomt in de oorsprong van replicatie ^1. Voorbij de oorsprong, wordt SeqA vinden op de replicatie vorken, waar het onlangs gerepliceerd DNA organiseert in hogere geordende structuren ^2. SeqA associeert slechts zwak met enkele GATC sequenties, maar het vormt een hoge affiniteit complexen met DNA duplexen met meerdere GATC sites. De minimale functionele en structurele eenheid SeqA een dimeer, daardoor verklarend de eis van ten minste twee sequenties GATC een hoge affiniteit complex met DNA hemimethylated ^3. Bovendien, de SeqA architectuur met de oligomerisatie en DNA-bindende domeinen gescheiden door een flexibele linker, kan binden aan GATC herhalingen gescheiden door maximaal drie spiraalvormige bochten. Daarom begrijpen van de functie van SeqA op moleculair niveau heeft de structurele analysis van SeqA gebonden aan meerdere GATC sequenties. In eiwit-DNA kristallisatie kan DNA hebben een uitzonderlijke Geen effect op de verpakking interacties afhankelijk van de relatieve afmetingen en structuur van het eiwit en DNA. Als het eiwit is hoger dan de DNA of voetafdrukken meeste DNA, wordt de kristalpakking hoofdzakelijk gemedieerd door eiwit-eiwit interacties. Omgekeerd, wanneer het eiwit even groot of kleiner dan de DNA of slechts betrekking op een fractie van de DNA, DNA-DNA en DNA-eiwit interacties domineren kristalpakking. Daarom kristallisatie van eiwit-DNA-complexen vereist een systematische screening van DNA lengte ⁴ en DNA-uiteinden (stomp of overhang) ^5-7. In dit rapport beschrijven we hoe te ontwerpen, te optimaliseren, te zuiveren en kristalliseren hemimethylated DNA duplexen met tandem GATC herhalingen in complex met een dimeer variant van SeqA (SeqAΔ (41 tot 59)-A25R) om kristallen geschikt voor structuurbepaling te verkrijgen.

Protocol

1. Protein Purification De flexibele linker die de N-(oligomerisatie) en C-terminal (DNA binding) domeinen van SeqA steun erkenning van hemimethylated GATC herhalingen gescheiden door een tot drie slagen op het DNA. Voor deze studie hebben we een dimere variant van SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) met een puntmutatie in het N-terminale domein dat verdere oligomerisatie en verkorte linker die DNA binden tandem GATC herhaalt uitsluitend gescheiden beperkt voorkomt een slag op het DNA (Figuur 1…

Discussion

Een van de grootste uitdagingen in macromoleculaire X-ray kristallografie is het verkrijgen van diffractie kwaliteit kristallen. Bij eiwit of eiwit-DNA-complexen, is deze uitdaging door de extra variabelen die moeten worden geoptimaliseerd verergerd. Het wordt algemeen aangenomen dat de lengte van de DNA en de aanwezigheid van kleverige overhangen aan associatie van aangrenzende DNA-moleculen te verbeteren in een langere pseudo-duplex worden de belangrijkste parameters te optimaliseren. We hebben echter aangetoond dat d…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue #	Comments (optional)
TRIS	Bioshop	TRS003.5
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	E478-500
Dithiotheitrol (DTT)	Bio Basic Inc.	DB0058
NaCl	Bioshop	SOD002.10
Glycerol	Caledon	5350-1
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016-500G
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Bioshop	SDS001.500
Urea	Bioshop	URE001.5
40% 29:1 Bis/acrylamide	Bio Basic Inc.	A0007-500ml	Store at 4 °C
Boric acid	EMD	BX0865-1
Xylene cyanol FF	Bio-Rad	161-0423
Bromophenol Blue	Bioshop	BR0222
Dual Adjustable Vertical Gel System	C.B.C. Scientific Company Inc.	DASG-250
Index crystallization screen	Hampton Research	HR2-144	Store at 4 °C
Wizard I crystallization screen	Emerald BioSystems	EBS-WIZ-1	Store at 4 °C
Wizard II crystallization screen	Emerald BioSystems	EBS-WIZ-2	Store at 4 °C
Classics crystallization screen	Qiagen	130701	Store at 4 °C
Intelliplate trays	Art Robbins Instruments	102-0001-00
			Solutions Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol. Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol. Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C. 2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C. 10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C. 10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature.