Itératif d'optimisation des duplex d'ADN pour la cristallisation des complexes ADN-SEQA

Summary

Structure cristalline des complexes protéine-ADN peuvent donner une idée fonction de la protéine, mécanisme, ainsi que la nature de l'interaction spécifique. Nous rapportons ici comment optimiser la durée, la séquence et extrémités de l'ADN double brin pour la co-cristallisation avec<em> Escherichia coli</em> SEQA, un régulateur négatif de l'initiation de la réplication.

Abstract

Escherichia coli SEQA est un régulateur négatif de la réplication de l'ADN qui empêche prématurés événements réinitiation par séquestrants hémiméthylé grappes GATC au sein de l'origine de réplication ^1. Au-delà de l'origine, SEQA se trouve à la fourche de réplication, où il organise l'ADN nouvellement répliqué par une augmentation des structures ordonnées ^2. SEQA que faiblement associés avec des séquences GATC simples, mais il forme des complexes de haute affinité avec les duplexes d'ADN contenant plusieurs sites GATC. L'unité minimale fonctionnelle et structurelle de SEQA est un dimère, ce qui explique l'exigence d'au moins deux séquences GATC pour former un complexe de haute affinité avec l'ADN hémiméthylé ^3. En outre, l'architecture SEQA, avec l'oligomérisation et de liaison d'ADN domaines séparés par un lieur flexible, permet la liaison de répétitions GATC séparés par jusqu'à trois spires hélicoïdales. Par conséquent, la compréhension de la fonction de SEQA au niveau moléculaire nécessite la structure analyse des SEQA lié à de multiples séquences GATC. En protéine-ADN cristallisation, l'ADN peut n'en ai pas à un effet exceptionnel sur les interactions d'emballage en fonction de la taille relative et l'architecture de la protéine et l'ADN. Si la protéine est plus grande que la plupart des empreintes d'ADN ou de l'ADN, l'empilement cristallin est principalement médié par interactions protéine-protéine. A l'inverse, lorsque la protéine est de la même taille ou plus petite que l'ADN ou ne couvre qu'une fraction de l'interaction ADN, ADN-ADN et l'ADN-protéine dominer empilement cristallin. Par conséquent, la cristallisation de complexes protéine-ADN nécessite le dépistage systématique de longueur ⁴ de l'ADN et l'ADN (extrémités émoussées ou faux) ^5-7. Dans ce rapport, nous décrivons comment concevoir, optimiser, de purifier et cristalliser duplex d'ADN contenant des répétitions en tandem hémiméthylé GATC dans un complexe avec une variante dimère de SEQA (SeqAΔ (41-59)-A25R) pour obtenir des cristaux appropriés pour déterminer la structure.

Protocol

1. Purification des protéines La séquence de liaison flexible reliant l'. N-(oligomérisation) et C-terminal (liaison à l'ADN) domaines de SEQA aides à la reconnaissance des répétitions hémiméthylé GATC séparées par une à trois spires de l'ADN Pour cette étude, nous avons utilisé une variante de dimère de SEQA (SeqAΔ (41-59)-A25R) avec une mutation ponctuelle dans le domaine N-terminal qui empêche davantage d'oligomérisation et un lieur raccourci qui limite li…

Discussion

Un des plus grands défis dans macromoléculaire cristallographie aux rayons X est d'obtenir des cristaux de qualité de diffraction. Dans le cas des complexes de protéines ou de protéines-ADN, ce défi est exacerbée en raison des variables supplémentaires qui doivent être optimisés. Il est largement admis que la longueur de l'ADN et la présence de surplombs collantes pour renforcer l'association de molécules d'ADN voisines dans un pseudo-duplex plus sont les principaux paramètres à optimiser. …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue #	Comments (optional)
TRIS	Bioshop	TRS003.5
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	E478-500
Dithiotheitrol (DTT)	Bio Basic Inc.	DB0058
NaCl	Bioshop	SOD002.10
Glycerol	Caledon	5350-1
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016-500G
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Bioshop	SDS001.500
Urea	Bioshop	URE001.5
40% 29:1 Bis/acrylamide	Bio Basic Inc.	A0007-500ml	Store at 4 °C
Boric acid	EMD	BX0865-1
Xylene cyanol FF	Bio-Rad	161-0423
Bromophenol Blue	Bioshop	BR0222
Dual Adjustable Vertical Gel System	C.B.C. Scientific Company Inc.	DASG-250
Index crystallization screen	Hampton Research	HR2-144	Store at 4 °C
Wizard I crystallization screen	Emerald BioSystems	EBS-WIZ-1	Store at 4 °C
Wizard II crystallization screen	Emerald BioSystems	EBS-WIZ-2	Store at 4 °C
Classics crystallization screen	Qiagen	130701	Store at 4 °C
Intelliplate trays	Art Robbins Instruments	102-0001-00
			Solutions Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol. Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol. Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C. 2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C. 10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C. 10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature.