מבנה הגבישי של קומפלקסים-DNA חלבון יכול לספק תובנות לגבי תפקוד חלבון, מנגנון, כמו גם, את אופי האינטראקציה הספציפית. כאן, אנו מדווחים איך לייעל את האורך, רצף וקצוות של DNA דופלקס להתגבשות שיתוף עם<em> חיידקי Escherichia</em> SeqA, רגולטור שלילי של ייזום שכפול.
Escherichia coli SeqA הוא רגולטור שלילי של שכפול הדנ"א שמונע פגי אירועי reinitiation לפי אשכולות GATC hemimethylated sequestering בתוך המקור של שכפול 1. מעבר למקור, SeqA נמצא במזלגות שהכפולים, שבו הוא מארגן את ה-DNA המשוכפל חדשה למבנים מסודרים גבוהים יותר 2. מקורבי SeqA רק בחולשה עם רצפי GATC בודדים, אבל הוא יוצר קומפלקסי זיקה גבוהות עם דופלקסים DNA המכילים אתרי GATC מרובים. היחידה התפקודית ומבנית המינימאלית של SeqA היא דימר, ובכך הסבירה את הדרישה של לפחות שני רצפי GATC כדי ליצור מורכבות-זיקה גבוהה עם DNA hemimethylated 3. בנוסף, ארכיטקטורת SeqA, עם oligomerization ותחומי ה-DNA מחייבים מופרדים מקשר גמיש, מאפשרת מחייבת לחוזר GATC המופרד עד שלושה סיבובי סליל. לפיכך, הבנת הפונקציה של SeqA ברמה מולקולרית דורשת ana המבניתמוגה של SeqA חייבת רצפי GATC מרובים. בהתגבשות החלבון ה-DNA, ה-DNA יכול להיות אף להשפעה יוצאת דופן על אינטראקציות האריזה בהתאם לגדלים והארכיטקטורה היחסיים של החלבונים והדנ"א. אם החלבון הוא גדול יותר מאשר ה-DNA או טביעות רגליים של רוב ה-DNA, אריזת הגביש מתווכת בעיקר על ידי אינטראקציות בין חלבונים. לעומת זאת, כאשר החלבון הוא באותו גודל או קטן יותר מאשר DNA או שהוא מכסה חלק קטן של ה-DNA, ה-DNA DNA-DNA וחלבון האינטראקציות רק שולט אריזת גביש. לכן, התגבשות של קומפלקסים-DNA חלבון דורשת הקרנה השיטתית של 4 אורך הדנ"א ומסתיים DNA (בוטה או סככה) 5-7. בדו"ח זה, אנו מתארים כיצד לעצב, לייעל, לטהר ולהתגבש דופלקסים DNA המכילים hemimethylated חוזר טנדם GATC במתחם בוריאצית dimeric של SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) כדי לקבל גבישים מתאימים לקביעת מבנה.
אחד האתגרים הגדולים ביותר בקריסטלוגרפיה macromolecular רנטגן הוא קבלת גבישים באיכות עקיפה. במקרה של חלבון או חלבון-DNA תסביכים, אתגר זה מתעצם בשל משתנים הנוספים שצריך להיות מותאמים. הוא האמין נרחב כי אורכו של ה-DNA ואת הנוכחות של מסוכך דביק כדי לשפר את הקשר בין מולקולות דנ"א …
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות לצוות PXRR בNSLS (ברוקהייבן המעבדה הלאומית) לקבלת סיוע במהלך איסוף נתונים ומוניקה Pillon לעזרה בטיהור ה-DNA. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי לחקר בריאות (MOP 67189).
Name of the reagent | Company | Catalogue # | Comments (optional) |
TRIS | Bioshop | TRS003.5 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | |
Dithiotheitrol (DTT) | Bio Basic Inc. | DB0058 | |
NaCl | Bioshop | SOD002.10 | |
Glycerol | Caledon | 5350-1 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016-500G | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.500 | |
Urea | Bioshop | URE001.5 | |
40% 29:1 Bis/acrylamide | Bio Basic Inc. | A0007-500ml | Store at 4 °C |
Boric acid | EMD | BX0865-1 | |
Xylene cyanol FF | Bio-Rad | 161-0423 | |
Bromophenol Blue | Bioshop | BR0222 | |
Dual Adjustable Vertical Gel System | C.B.C. Scientific Company Inc. | DASG-250 | |
Index crystallization screen | Hampton Research | HR2-144 | Store at 4 °C |
Wizard I crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-1 | Store at 4 °C |
Wizard II crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-2 | Store at 4 °C |
Classics crystallization screen | Qiagen | 130701 | Store at 4 °C |
Intelliplate trays | Art Robbins Instruments | 102-0001-00 | |
Solutions Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol. Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol. Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C. 2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C. 10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C. 10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. |