SeqA डीएनए परिसर Crystallization लिए डीएनए duplexes के अनुकूलन चलने
Summary
प्रोटीन डीएनए परिसरों की क्रिस्टल संरचना प्रोटीन समारोह, तंत्र, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विशेष बातचीत की प्रकृति में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. यहाँ, हम कैसे रिपोर्ट के साथ सह – crystallization के लिए लंबाई, अनुक्रम और द्वैध डीएनए के सिरों का अनुकूलन करने के लिए<em> Escherichia कोलाई</em> SeqA, प्रतिकृति दीक्षा का एक नकारात्मक नियामक.
Abstract
Escherichia कोलाई SeqA डीएनए प्रतिकृति के एक नकारात्मक नियामक है कि 1 प्रतिकृति की उत्पत्ति के भीतर sequestering hemimethylated GATC समूहों द्वारा समयपूर्व reinitiation घटनाओं रोकता है. मूल के परे, SeqA प्रतिकृति कांटे, 2 जहां यह उच्च आदेश दिया संरचनाओं में नव दोहराया डीएनए का आयोजन में पाया जाता है. SeqA सहयोगियों एकल GATC दृश्यों के साथ ही कमजोर है, लेकिन यह कई GATC साइटों युक्त डीएनए duplexes साथ उच्च आत्मीयता परिसरों रूपों. SeqA की न्यूनतम कार्यात्मक और संरचनात्मक इकाई डिमर एक है, जिससे कम से कम दो GATC दृश्यों लिए hemimethylated 3 डीएनए के साथ एक उच्च आत्मीयता जटिल बनाने की आवश्यकता को समझा. इसके अतिरिक्त, oligomerization और डीएनए बाध्यकारी एक लचीला linker द्वारा अलग डोमेन के साथ SeqA वास्तुकला, GATC दोहराता तीन पेचदार बदल जाता है अलग करने के लिए बाध्य करने की अनुमति देता है. इसलिए, एक आण्विक स्तर पर SeqA के समारोह को समझने संरचनात्मक एना की आवश्यकताlysis SeqA के कई GATC दृश्यों के लिए बाध्य है. प्रोटीन डीएनए crystallization में, डीएनए पैकिंग प्रोटीन और डीएनए के सापेक्ष आकार और वास्तुकला के आधार पर बातचीत पर एक असाधारण प्रभाव करने के लिए कोई नहीं हो सकता है. यदि प्रोटीन डीएनए या डीएनए के सबसे पैरों के निशान से भी बड़ा है, क्रिस्टल पैकिंग में मुख्य रूप से प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत द्वारा मध्यस्थता है. इसके विपरीत, जब एक ही प्रोटीन या डीएनए की तुलना में आकार छोटा है या यह केवल डीएनए, डीएनए डीएनए और प्रोटीन डीएनए बातचीत का एक अंश शामिल क्रिस्टल पैकिंग पर हावी है. इसलिए, प्रोटीन डीएनए परिसरों की crystallization डीएनए लंबाई 4 और डीएनए (कुंद या की अधिकता) समाप्त होता है 5-7 की व्यवस्थित जांच की आवश्यकता है. इस रिपोर्ट में, हम वर्णन कैसे डिजाइन, अनुकूलन करने के लिए, शुद्ध और hemimethylated परिसर में डीएनए की एक dimeric संस्करण SeqA ((41-59 SeqAΔ) A25R) संरचना निर्धारण के लिए उपयुक्त क्रिस्टल प्राप्त करने के साथ मिलकर GATC दोहराता युक्त duplexes मणिभ बनाना.
Protocol
Discussion
Macromolecular एक्स – रे क्रिस्टलोग्राफी में सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक विवर्तन गुणवत्ता क्रिस्टल प्राप्त है. प्रोटीन या प्रोटीन डीएनए परिसरों के मामले में, इस चुनौती का अतिरिक्त चर कि अनुकूलित किया जाना चा…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के NSLS (Brookhaven राष्ट्रीय प्रयोगशाला) में डेटा संग्रह और मोनिका Pillon के दौरान सहायता के लिए डीएनए शुद्धि के साथ मदद के लिए PXRR स्टाफ का शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ. यह काम स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा (67,189 एमओपी) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue # | Comments (optional) |
| TRIS | Bioshop | TRS003.5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | |
| Dithiotheitrol (DTT) | Bio Basic Inc. | DB0058 | |
| NaCl | Bioshop | SOD002.10 | |
| Glycerol | Caledon | 5350-1 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016-500G | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.500 | |
| Urea | Bioshop | URE001.5 | |
| 40% 29:1 Bis/acrylamide | Bio Basic Inc. | A0007-500ml | Store at 4 °C |
| Boric acid | EMD | BX0865-1 | |
| Xylene cyanol FF | Bio-Rad | 161-0423 | |
| Bromophenol Blue | Bioshop | BR0222 | |
| Dual Adjustable Vertical Gel System | C.B.C. Scientific Company Inc. | DASG-250 | |
| Index crystallization screen | Hampton Research | HR2-144 | Store at 4 °C |
| Wizard I crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-1 | Store at 4 °C |
| Wizard II crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-2 | Store at 4 °C |
| Classics crystallization screen | Qiagen | 130701 | Store at 4 °C |
| Intelliplate trays | Art Robbins Instruments | 102-0001-00 | |
Solutions Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol. Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol. Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C. 2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C. 10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C. 10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. |
References
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