Summary
Wir beschreiben einen elektrochemischen Sensor Testverfahren zum schnellen Nachweis von Bakterien und Identifikation. Der Test umfasst eine Sensoranordnung mit DNA-Oligonukleotid-Capture-Sonden für die ribosomale RNA (rRNA) artspezifische Sequenzen funktionalisiert. Sandwich-Hybridisierung der Ziel-rRNA mit dem Capture-Sonde und einem Meerrettichperoxidase-linked DNA-Oligonukleotid Detektorsonde erzeugt eine messbare amperometrischen Strom.
Abstract
Elektrochemische Sensoren sind weit verbreitet für die schnelle und genaue Messung des Blutzuckerspiegels verwendet werden und kann für den Nachweis einer Vielzahl von Analyten angepasst werden. Elektrochemische Sensoren arbeiten nach Transduktion einer biologischen Erkennung Veranstaltung in ein nützliches elektrisches Signal um. Die Signalübertragung erfolgt durch Koppeln der Aktivität eines Redox-Enzym zu einer amperometrischen Elektrode. Sensor Spezifität entweder eine inhärente Eigenschaft des Enzyms Glucoseoxidase bei einer Glucose-Sensor, oder ein Produkt der Verknüpfung zwischen dem Enzym und einem Antikörper oder der Sonde.
Hier beschreiben wir einen elektrochemischen Sensor Assay-Verfahren direkt zu erfassen und zu identifizieren Bakterien. In jedem Fall sind die hier beschriebenen DNA-Sonden-Oligonukleotide. Diese Methode basiert auf Sandwich-Hybridisierung von capture und der Fühler mit Ziel ribosomalen RNA (rRNA) basiert. Die Fänger-Sonde an den Sensor Oberfläche verankert, während der Detektor-Sonde an h gebunden istorseradish Peroxidase (HRP). Wenn ein Substrat, wie 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) mit einer Elektrode mit capture-Ziel-Detektor Komplexe gebunden an dessen Oberfläche zugegeben wird, wird das Substrat durch HRP oxidiert und reduziert durch die Arbeitselektrode. Das Redox-Zyklus führt pendelt der Elektronen durch das Substrat von der Elektrode zum HRP, wodurch Strom in der Elektrode.
Introduction
Mit rRNA als Zielmolekül für bakterielle Nachweis und zur Identifizierung hat eine Reihe von Vorteilen. Die Fülle der rRNA in bakteriellen Zellen sorgt für eine Nachweisgrenze von nur 250 Bakterien pro Milliliter, ohne die Notwendigkeit für Zielamplifikation 1. Bakterielle rRNA enthält eindeutige Spezies-spezifischen Sequenzen, die zugänglich Hybridisierung mit DNA-Sonden sind. Folglich kann eine Anordnung von elektrochemischen Sensoren verwendet werden, um unbekannte Bakterien, wobei jeder Sensor mit einer unterschiedlichen Spezies-spezifische Fangsonde funktionalisierte identifizieren. Positive Control-Sensoren sollten für ein synthetisches Oligonukleotid Ziel, dass "Brücken" die Gefangennahme und der Fühler eine interne Kalibrierung zu erzeugen einbezogen werden.
Elektrochemische Sensoren haben eine breite Palette von Grundlagenforschung und translationale Forschung. Zum Beispiel beschriebene Test hier wurde verwendet, um präzise die Wirkung von E. coli Wachstumsphase auf RRnA und pre-rRNA Kopie Zahlen, die von großem Interesse für die Forscher in der bakteriellen Physiologie 2 interessiert ist. Die Empfindlichkeit des elektrochemischen Sensors Assay wird durch das Signal-Rausch-Verhältnis bestimmt. Eine Vielzahl von Signalverstärkung und Rauschunterdrückung Methoden erforscht worden. Wir finden, dass die Verbesserung der Chemie der Sensoroberfläche Schlüssel zur Verringerung der unspezifischen Bindung von Detektor-Sonde und / oder HRP-Enzym. Insbesondere wurde eine gemischte Monoschicht Alkandithiolen und Mercaptohexanol erwiesen Hintergrund durch Abdecken der Elektrodenoberfläche vollständiger Beibehaltung Zugänglichkeit der Einfang-Sonde für Zielhybridisierung 3 zu reduzieren. Diese Oberflächenchemie Behandlungen sind besonders wichtig für die Assays, die komplexen biologischen Proben.
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Protocol
1. Funktionalisierung von Elektrochemische Sensoren
- Vorbereiten des thiolierten Fangsonde mit einer Konzentration von 0,05 uM in 300 uM 1,6-Hexandithiol (HDT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA und Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur für 10 min . Inkubation der thiolierten Einfangsonde mit HDT sorgt dafür, dass die Thiolgruppe auf der Capture-Sonde reduziert wird, was zu mehr konsistente Ergebnisse.
- Tragen Sie einen Stickstoffstrom auf blankem Gold 16 Sensorarraychips (e) für 5 Sek. Feuchtigkeit und / oder Partikel zu entfernen.
- Übernehmen 6 ul der HDT-thiolierten Einfangsonde Mix zur Arbeitselektrode aller 16 Sensoren des Sensor-Arrays und speichern den Sensorchip (s) in einem überdachten Petrischale bei 4 ° C über Nacht. Thiolierte Fangsonden binden direkt auf den blanken Goldelektrode und der HDT wirkt, um Überspritzungen der Fangsonden verhindern und halten sie in einer gestreckten Konformation, die eine Hybridisierung mit dem Ziel fördert.
- Diefolgenden Tag, waschen Sie den Sensor-Chip mit deionisiertem H 2 O für 2-3 sec und trocken unter einem Strom von Stickstoff für 5 sek.
- Anwenden 6 ul 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM 6-Mercapto-1-hexanol (MCH) an die Arbeitselektrode von allen Sensoren 16 und Inkubation für 50 min. Dieser und alle nachfolgenden Sensorchip Inkubationen werden in einem bedeckten Petrischale bei Raumtemperatur durchgeführt. MCH wirkt als Blockierungsmittel, Auffüllen der Lücken in dem thiolierten Fangsonde oder HDT nicht vorhanden ist auf der Elektrodenoberfläche.
2. Probenvorbereitung
- 1 ml der Bakterienkultur in der logarithmischen Wachstumsphase (OD 600 ≈ 0,1) zu einem Mikrozentrifugenröhrchens und Zentrifuge bei 16.000 xg für 5 min. Entfernen Sie den Kulturüberstand. Das bakterielle Pellet kann unmittelbar weiterverarbeitet oder bei -80 ° C für die spätere Verwendung.
- Gründlich resuspendieren die bakterielle Pellet in 10 ul 1 M NaOH, indem die Pipettenspitze zu dem Bottom des Mikrozentrifugenröhrchens und Auf-und Abpipettieren mehrmals. Inkubieren der Suspension bei Raumtemperatur für 5 min.
- Neutralisieren des bakteriellen Lysat durch Zugabe von 50 ul 1 M Phosphatpuffer, pH 7,2, enthaltend 2,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,25 mM eines Fluorescein-modifizierten Detektorsonde. Inkubieren des neutralisierten Lysats für 10 min bei Raumtemperatur. Fluorescein-modifizierten Detektorsonden mit bakteriellen rRNA Zielmoleküle hybridisieren.
3. Elektrochemische Sensor Assay
- Waschen der MCH vom Sensorchip mit deionisiertem H 2 O für 2-3 Sekunden gewaschen und unter einem Stickstoffstrom für 5 Sekunden.
- Übernehmen 4 ul neutralisiert Bakterienlysat zur Arbeitselektrode jeder 14 Sensoren und die Proben für 15 min. Ziel-Detektorsonde Komplexe immobilisiert thiolierten Fangsonden hybridisieren.
- Übernehmen 4 ul 1 nM Überbrückungsoligonukleotids in 1 M Phosphatpuffer, pH 7,2, mit 2,5% BSA und 0,25 μ M Fluorescein-modifizierten Detektorsonde bis 2 positive Kontrolle Sensoren (für Signal-Normalisierung) und Inkubation für 15 min.
- Waschen des Sensorchips mit deionisiertem H 2 O für 2-3 Sekunden gewaschen und unter einem Stickstoffstrom für 5 Sekunden.
- Übernehmen 4 ul von 0,5 U / ml anti-Fluorescein-HRP in 1 M Phosphatpuffer, pH 7,2, mit 0,5% Casein zur Arbeitselektrode aller 16 Sensoren und die Proben für 15 min. Die Anti-Fluorescein-HRP bindet an die immobilisierten fluoresceinmodifiziertem der Fühler.
- Waschen des Sensorchips mit deionisiertem H 2 O für 2-3 Sekunden gewaschen und unter einem Stickstoffstrom für 5 Sekunden.
- Tragen Sie einen Film auch Aufkleber auf der Oberfläche des Sensorchips und Last in den Sensor-Chip Halterung. Je 50 ul TMB Substrat, auf allen 16 Sensoren und schließen Sie den Sensor-Chip Halterung.
- Erhalten Amperometrie und Cyclovoltammetrie Messungen für alle 16 Sensoren mit der Helios Chip Reader. Amperometric Strom ist proportional zur Geschwindigkeit der TMB reduction auf der Sensoroberfläche (siehe Abbildung 1).
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Representative Results
Wir beschreiben einen elektrochemischen Assay, ähnlich einer Sandwich-ELISA strukturiert. Wie in 1, Ziel ribosomalen RNA (rRNA) Hybridisierung mit Erfassung und der Fühler durch eine Redox-Reaktion katalysiert HRP konjugiert an Anti-Fluorescein-Antikörper-Fragmente, die an das 3'-Fluorescein-Verknüpfung gebunden auf dem Detektor-Sonde entwickelt gezeigt. Ein wichtiger Bestandteil der Empfindlichkeit des Assays ist die Oberflächenchemie des Goldelektrode. Wir haben gefunden, dass eine ternäre Monoschicht aus thiolierten Fangsonden Mercaptohexanol und Hexandithiol verbessert das Signal-zu-Rausch-Verhältnis durch Reduktion unspezifischer Hintergrund Bindung des Reporter-Protein 3. Die hier beschriebenen Assays verwenden ein GeneFluidics 16 Sensorarraychips in Abbildung 2 dargestellt. Jeder der Sensoren in der Anordnung enthalten drei Elektroden arbeiten, Referenz-und Hilfsstoffe, die Kontaktpunkte an der Kante des Chips 4. Der Chip lesener hat Pogo-Pins, die mit jeder der Kontaktstellen verbinden. Die Chip-Leser dient als Schnittstelle für die Sensoranordnung mit einem Potentiometer durch einen Computer-Algorithmus gesteuert.
Beispiele für elektrochemische Sensor Stromflusses in Abbildung 3 dargestellt. Der Stromfluss in den Sensoren ist künstlich hoch während der ersten Sekunden nach dem amperometrischen Messungen aufgrund der Akkumulation von oxidiertem Substrat beginnen während der Zeit von der Anwendung des TMB in die Sensoroberfläche zum Einleiten der Leser Algorithmus. Stromfluss schnell einen stabilen Zustand erreicht und genaue Sensordaten zuverlässig innerhalb 60 Sekunden erhalten werden. Sensor-Assays sind in der Regel in zweifacher Ausfertigung als interne Kontrolle für Sensor Variabilität durchgeführt. Wir haben gefunden, dass der Sensor-zu-Messaufnehmer-Variabilität relativ konstant ist, so ist es möglich, 16 verschiedene Assays Sensor parallel zu den GeneFluidics 16 Sensorarraychips durchzuführen. Positive und negative Kontrollen sind essenTiAl. Als positive Kontrolle schließen wir ein synthetisches "Bridging"-DNA-Oligonukleotid, das sowohl für die Erfassung und Detektor-Sonden hybridisiert und als synthetische Target mit bekannter Konzentration. Auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse mit den Überbrückungsoligonukleotids fungiert als interne Kalibrierung Kontrolle zu Chip-to-Chip-Variation zu minimieren.
Beim Testen Erfassung und der Fühler sollte die Nachweisgrenze durch serielle Verdünnung einer Probe mit bekannter Konzentration bestimmt werden. Wie in 4 gezeigt, gibt es eine log-log-lineare Korrelation zwischen Konzentration der Probe und Signalausgabe über den dynamischen Bereich des Tests. Die Nachweisgrenze ist als die Konzentration der Target benötigt, um ein Signal, das 3,29 Standardabweichungen größer ist als der Mittelwert der Hintergrund-Signale erzeugen 5 definiert. Zur Identifizierung von Bakterien in einer unbekannten Probe, die eine Bandbreite von sachdienlichen Abscheidung und Detektor-Paare ausgewählt. Die Wahl der Sonden is bestimmt durch die Art der Bakterien in einer bestimmten Art der Probe vermutet wird. Natürlich ungewöhnlichen Bakterien können gelegentlich in keiner Probe gefunden werden, so dass wir empfehlen, dass ein eubakteriellen Sondenpaar aufgenommen werden, dass die Fähigkeit hat, die konservierten Regionen rRNA von Bakterien hybridisieren. Abbildung 5 zeigt repräsentative Ergebnisse für Proben mit E. coli und K. pneumoniae, die häufig im Urin von Patienten mit Infektion der Harnwege zu finden sind. Das für die meisten der Sensoren wird niedrig und dergleichen, und diese negativen Ergebnisse kann als Hintergrund-Signal zusammengefasst werden.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der elektrochemischen Sensor-Assay. Die Gold-Elektrode ist mit Mercaptohexanol und Hexandithiol beschichtet und funktionalisiert durch Zugabe von DNA-Oligonukleotid thiolierten Fangsonden (blau). Sandwich hybridization des 16S-rRNA-Target-DNA mit dem Oligonukleotid-Capture-Sonde und Fluorescein-markierten DNA-Oligonukleotid Detektorsonde (rot), führt zu einem Komplex, der durch Zugabe von Anti-Fluorescein ist - Meerrettichperoxidase (HRP)-Konjugat und TMB-Substrat. Amperometrische Strom wird durch den Redox-Zyklus erzeugt, die sich aus der Oxidation von TMB HRP und Verringerung der TMB durch Elektronen von der Elektrode.
Abbildung 2. . Identifizierung von Bakterien Sensoranordnung und Chiphalterung Jeder Sensor in der Anordnung besteht aus drei Elektroden: eine zentrale Arbeitselektrode, eine Referenzelektrode und Umfangsrichtung eine Hilfselektrode zur Stabilisierung des Signals. Die Arbeitselektroden jedes Sensors in dem Array mit einer Gruppe von Capture-Sonden, die spezifisch für bakterielle Spezies von Interesse funktionalisiert (siehe Tabelle 3), wie wir ll als EU (Eubakterien) Fangsonde, die für alle bakteriellen 16S-rRNA-Molekülen und einem brol "Bridging"-Oligonukleotid, das als positive Kontrolle für Signalkalibrierung hybridisiert. Signal wird durch Anordnen des Arrays in einer Chip-Leser mit Pogostifte gemessen, die eine Schnittstelle mit der Sensor-Elektrode Kontaktstellen.
Abbildung 3. Amperometrische Stromausgang während der Messung. Amperometric Strom parallel für alle 16 Sensoren in der Anordnung gemessen. Der Stromfluss ist zunächst äußerst negativ aufgrund der Ansammlung von oxidiertem TMB Substrat, bevor Sie das Array mit dem Chip-Leser und dem Beginn der Messung. Danach aktuellen schnell stabilisiert und Sensor-Messwerte bei 60 sec aufgezeichnet. Elektroden mit größeren negativen Strom haben die höchsten Signale.
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Abbildung 4. Serielle zehnfacher Verdünnung von E. coli, um die Nachweisgrenze zu bestimmen. Sensoren wurden in zweifacher Ausfertigung mit serieller Zehnfachverdünnungen einer bekannten Konzentration von E. getestet coli Lysat. Die beobachteten Signals Lesungen, aufgetragen als schwarze Kreise, wurden verwendet, um eine idealisierte Signalverlauf vorherzusagen. Die gepoolte Standardabweichung für alle Wiederholungen und der Hintergrund-Signal an der niedrigsten Konzentration Ziel wurden verwendet, um die Nachweisgrenze (blaue Linie), als 3,29 Standardabweichungen über Hintergrund definiert berechnen.
Abbildung 5. Repräsentative elektrochemischen Sensor Testergebnisse für Escherichia coli und Klebsiella pneumoniae. E. coli und K. Pneumoniae wurden auf Reaktivität mit Sondenpaaren in den Tabellen 2 und 3 beschrieben getestet. Reaktivität mit dem KE Sondenpaar unterscheidet K. pneumoniae aus E. coli. Die Überbrückungsoligonukleotids (Bröl) dient als positive Kontrolle und interne Kalibrierung Standard.
| Sondenname | Ribosomalen Untereinheit und Ort * | Sequence |
| KE Cap 10m | 16S 74 | 5'-S-AGCTCTCTGT |
| KE Det 11m | 16S 63 | 5'-GCTACCGYTCG-F |
| EK Cap 15m | 23S 1492 | 5'-AGCCTTGATTTTCCG-S |
| EK Det 15m | 23S 1507 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EL Cap 17m | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAAAAGGTACCG-S |
| EL Cap 18m | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAADAAGGTACCG-S |
| EL Det 15m | 23S 1492 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EB Cap 23m | 16S 1275 | 5'-S-ACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCT |
| EB Det 23m | 16S 1252 | 5'-CGCGAGGTCGCCTTCCTTTGTAT-F |
| PM Cap 15m | 16S 183 | 5'-S-TTTGGTCCGTAGACA |
| PM Det 17m | 16S 166 | 5'-TTATGCGGTATTAGCCA-F |
| PA Cap 11m | 16S 453 | 5'-S-ACTTACTGCCC |
| PA Det 14m | 16S 439 | 5'-TTCCTCCCAACTTA-F |
| EU GN Cap 19m | 16S 1502 | 5'-S-GTTCCCCTACGGTTACCTT |
| EU Det 18m | 16S 1484 | 5'-GTTACGACTTCACCCCAG-F |
| EU Bröl 37m | 5'-CTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAAC |
Tabelle 2. DNA-Oligonukleotid-Sonde Pair Sequenzen. Capture (Cap) Sonden werden mit Thiol-Bindungen (S) synthetisiert. Detector (Det) Sonden werden mit Fluorescein (F) Modifikationen synthetisiert. Beachten Sie, dass Sondenpaaren entweder eine 5'-thiolierten Einfangsonde und eine 3'-Fluorescein-modifizierten Detektorsonde oder eine 3'-thiolierten Einfangsonde und ein 5'-Fluorescein-modifizierten Detektorsonde beinhalten. Die beiden EL Fängersonden vor der Verwendung gemischt. Um den Test zu vereinfachen, kann der Fühler jedem Sensor als eine Mischung ohne signifikante Kreuzreaktivität verwendet werden. KE - Klebsiella und Enterobacter, EK - E. coli und K. pneumoniae, EL - E. cloacae, EB - Familie Enterobacteriaceae, PM - P. mirabilis, PA - P. aeruginosa, EU - eubakteriellen, Bröl - Überbrückungsoligonukleotids. * - Lage nUmbra bezieht sich auf den Abstand vom Beginn der 16S-oder 23S-Gens.
| Bakterielle Species | Reaktive Sondenpaaren |
| Escherichia coli | EK + EB |
| Klebsiella pneumoniae | KE + EK + EB |
| Proteus mirabilis | PM + EB |
| Pseudomonas aeruginosa | PA |
| Enterobacter Spezies | KE + EB + EB oder EL oder KE + EL + EB |
Tabelle 3. Anerkennung von Bakterienarten durch Sondenpaaren.
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Discussion
Der elektrochemische Sensor beschriebenen Test hier ermöglicht die schnelle Detektion von Nukleinsäure-Targets. Sensitivität und Spezifität hängen teilweise von der freien Energie der Target-Sonden-Hybridisierung, die ihrerseits abhängig von der Länge und GC-Gehalt der Erfassung und der Fühler. Wir üblicherweise die Schritte Hybridisierung bei Raumtemperatur (~ 20 ° C) 5, 6. Jedoch können die Hybridisierung der Schritte (3.2 und 3.3) auch bei höheren Temperaturen in einem Wärmeschrank durchgeführt werden, wenn der Chip in einem abgedeckten Kammer angeordnet ist, mit angefeuchtetem Filterpapier Verdunstung 7, 8 verhindern. Optimal Signal mit Capture-Detektor-Paare, die zu benachbarten Stellen auf dem Nukleinsäure-Target ohne einen Spalt zwischen den Hybridisierungsstellen 8 hybridisieren erhalten. Diese Signalverstärkung wird gedacht, um von Basenpaar-Stapeln und durch die Erhöhung Hybridisierung Zugänglichkeit der angrenzenden Regionen, als "Helfer-Sonde"-Effekt bekannt zu arbeiten. Capture-Detektor-probe Hybridisierung an benachbarten Standorten ist auch wegen alkalische Lyse der Bakterien führt zu einer Fragmentierung des rRNA Target 5 wichtig. Dieses Verfahren kann zur Detektion von entweder RNA oder DNA-Targets aufgebracht werden, mit einer Vielzahl von klinischen und wissenschaftlichen Anwendungen. Zum Beispiel sollte es möglich sein, diese Methode zu verwenden, um zelluläre Funktionen, die von kleinen RNAs reguliert werden oder Antibiotikaresistenzgen Ziele entweder entweder als DNA oder mRNA erkennen studieren. Pre-amplication kann notwendig sein, um Ziele in geringer Kopienzahl erkennen. Darüber hinaus sollte RNAse-Inhibitoren bei der Probenvorbereitung, um den Abbau von potentiell instabile RNA-Zielen verhindern zugesetzt werden.
Dieses Verfahren hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Verfahren zum Nachweis und Identifizierung von Bakterien. Standard-klinischen Mikrobiologie Methoden erfordern Bakterienwachstum auf Agar-Medium für die Quantifizierung und Anwendung von Identifikations-Methoden. Wachstum von Bakterien zu sichtbaren Kolonien typischerweiseInkubation über Nacht erheblich verzögern die Zeit von der Probenentnahme auf die Berichterstattung der Ergebnisse. Es gibt ein großes Interesse an der Entwicklung einer schnelleren, molekulare Methoden der Erregernachweis, darunter elektrochemische Biosensoren 9. Es wurde jedoch wenig Aufmerksamkeit auf die Leistungsfähigkeit der DNA-Biosensoren in biologischen Proben roher gegeben worden. Der elektrochemische Sensor beschriebene Assay hier kann direkt auf die Serum-und Urinproben durchgeführt werden ohne einen signifikanten Verlust der Empfindlichkeit 7. Die Verwendung von Thiol-Einfang-Sonden und dem gemischten Monoschicht hier beschrieben macht die Sensorfläche gegen unspezifischen Proteinadsorption, Beibehaltung Empfindlichkeit in rohen biologischen Proben, einschließlich Serum oder Urin 10. So wenig wie 1 bakterielle Zelle pro Sensor (250 Bakterien pro Milliliter) nachweisbar sind, ist vergleichbar mit der Empfindlichkeit der PCR-Amplifikationstechniken 1. Mehrere PCR basierte Identifizierung von Bakterien Methoden wurden 11, 1 beschrieben2. Obwohl PCR potentiell erkennen kann weniger als Zielmoleküle der elektrochemische Sensor Assay hier beschrieben, wurden PCR-basierte Verfahren beschränkt Annahme aufgrund des hohen apparativen Erfassung und / oder Kosten für Reagenzien, bezogen auf klinischen Standard-Methoden der Molekularbiologie erreicht. Im Gegensatz dazu sind elektrochemische Sensoren relativ kostengünstig herzustellen. Obwohl die Elektroden Gold Sputtern, hergestellt sind bei der Goldmenge pro Chip gering, da die Dicke der Elektrode ist nur 1.000 Angström.
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Disclosures
Alle Autoren sind Erfinder von Patenten relevant zu den beschriebenen Methoden. Eines dieser Patente hat Qvella Corporation lizenziert. BMC und DAH haben Kapitalanteil in Qvella Corporation. VG ist der Präsident der GeneFluidics, die der Hersteller der elektrochemischen Sensor-Array-Chip, Chip-Halterung und Chip-Leser in diesem Papier beschrieben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von Cooperative Agreement Auszeichnung AI075565 (bis DAH) von der National Institute of Allergy and Infectious Diseases und durch die Wendy und Ken Rubin Fund for Excellence in Pediatric Urology Forschung gefördert. BMC ist die Judith und Robert Winston Chair in Pediatric Urology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. | |||
References
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