Summary
Мы описываем анализ электрохимических датчиков метод для быстрого бактериального обнаружения и идентификации. Анализ включает в себя датчик массива функционализированы олигонуклеотида захвата зондов для рибосомной РНК (рРНК) видоспецифической последовательностей. Сэндвич-гибридизации целевых рРНК с зондом захвата и пероксидазой хрена олигонуклеотида, детектор зонд производит измеримые амперометрического тока.
Abstract
Электрохимические датчики широко используются для быстрого и точного измерения уровня глюкозы в крови и может быть адаптирована для обнаружения широкого спектра анализируемых веществ. Электрохимические датчики работают по трансдукции биологических распознавание событий в полезный электрический сигнал. Передача сигнала происходит путем соединения активность окислительно-восстановительных ферментов для амперометрического электрода. Датчик специфичность либо неотъемлемой характеристикой ферментов глюкозооксидазы в случае сенсор глюкозы, или продукт связь между ферментом и антитела или зонда.
Здесь мы описываем анализа электрохимического датчика метод непосредственного обнаружения и идентификации бактерий. В любом случае, зонды, описанные здесь, представляют собой ДНК-олигонуклеотидов. Этот метод основан на гибридизации сэндвич захвата и датчики пламени с целевыми рибосомной РНК (рРНК). Захват зонда прикреплен к поверхности датчика, а детектор зонд связан с чorseradish пероксидазы (HRP). Когда субстрат, такой как 3,3 ', 5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ) в электроде с захватом-мишень-детектор комплексы, связанные с его поверхности, субстрат окисляется пероксидазой хрена, и уменьшается на рабочем электроде. Этот результат окислительно-восстановительного цикла в челночные электронов на подложке из электрода для HRP, производя тока в электроде.
Introduction
Использование рРНК в качестве молекулы-мишени для бактериальной обнаружения и идентификации имеет ряд преимуществ. Обилие рРНК в бактериальных клетках предусматривает предел чувствительности по цене от 250 бактерий на миллилитр без необходимости целевого усиления 1. Бактериальные рРНК содержит уникальный видоспецифических последовательностей, которые являются доступными для гибридизации с ДНК-зондами. Следовательно, множество электрохимических датчиков может быть использована для идентификации неизвестных бактерии, где каждый датчик функционализированных различных видов конкретного захвата зонда. Положительный контроль датчики должны быть включены в синтетический олигонуклеотид, который мишень "мостов" захват и детектор зондов создать внутренний сигнал калибровки.
Электрохимические датчики имеют широкий спектр основных и поступательного исследовательских задач. Например, анализ, описанный здесь был использован, чтобы точно измерить эффект E. кишечной фазе роста на RRNИ пре-рРНК числом копий, что представляет большой интерес для исследователей, заинтересованных в бактериальной физиологии 2. Чувствительность анализа электрохимического датчика определяется отношение сигнал-шум. Разнообразие усиления сигнала и методы шумоподавления были изучены. Мы считаем, что улучшение химии поверхности датчика является ключом к сокращению неспецифическое связывание зонда детектора и / или HRP фермента. В частности, смешанного монослоя alkanedithiols и mercaptohexanol было установлено, уменьшить фон путем покрытия поверхности электрода более полно, сохраняя при этом доступность захватывающего зонда для гибридизации мишень 3. Эти процедуры химии поверхности особенно важны для анализа с участием сложных биологических образцов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Функционализация электрохимическими сенсорами
- Подготовьте тиолированным зонд захвата в концентрации 0,05 мкМ 300 мкМ 1,6-hexanedithiol (HDT), 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,3 М NaCl, 1 мМ ЭДТА и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 10 мин . Инкубация тиолированным зонд захвата с HDT гарантирует, что тиольной группой захватывающего зонда уменьшается, что приводит к более надежные результаты.
- Применение в токе азота до чистого золота 16 матрицы датчика чип (ы) в течение 5 секунд для удаления влаги и / или твердых частиц.
- Применение 6 мкл HDT-тиолированным смесь зонд захвата к рабочему электроду всех 16 датчиков матричного датчика и хранить сенсорный чип (ы) в закрытом чашке Петри при температуре 4 ° С в течение ночи. Тиолированными зондов захвата связываются непосредственно с голым электродом золота и HDT действует, предотвращая переуплотнения захвата зондов и держать их в вытянутой конформации, что способствует гибридизации с мишенью.
- следующий день, мыть микросхемы датчика деионизированной H 2 O в течение 2-3 сек и сушат под потоком азота в течение 5 секунд.
- Применение 6 мкл 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,3 М NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ 6-меркапто-1-гексанола (MCH) к рабочему электроду всех 16 датчиков и инкубируют в течение 50 мин. Этот и все последующие инкубации чипа датчика выполняется в закрытой чашке Петри при комнатной температуре. MCH действует в качестве блокирующего агента, заполнение пробелов, где тиолированным зонд захвата или HDT не присутствует на поверхности электрода.
2. Подготовка образцов
- Передача 1 мл бактериальной культуры в логарифмической фазе роста (OD 600 ≈ 0.1) к трубке микроцентрифужных и центрифуге при 16000 х г в течение 5 мин. Удалить супернатант культуры. Бактериальный осадок может быть обработан немедленно, либо хранили при -80 ° С для последующего использования.
- Тщательно ресуспендируют бактериальный осадок в 10 мкл 1 М NaOH с применением пипетки к ботовТом трубки микроцентрифужные и пипетки вверх и вниз несколько раз. Инкубируют в суспензии при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Нейтрализовать бактериальный лизат добавлением 50 мкл 1 М фосфатного буфера, рН 7,2, содержащем 2,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,25 мМ флуоресцеином модифицированный детектор зонда. Инкубируют нейтрализованного лизат в течение 10 мин при комнатной температуре. Флуоресцеина модифицированных зондов детектор гибридизации с бактериальными целевых молекул рРНК.
3. Электрохимический сенсор анализа
- Промыть MCH от датчика чип деионизированной H 2 O в течение 2-3 сек и сушат под потоком азота в течение 5 секунд.
- Применение 4 мкл нейтрализованного бактериального лизата к рабочему электроду каждого из датчиков 14 и инкубировать в течение 15 мин. Target-детектор комплексов зонда гибридизации с иммобилизованными зондами тиолированными захвата.
- Применение 4 мкл 1 нМ преодоление олигонуклеотидов в 1 М фосфатного буфера, рН 7,2, содержащем 2,5% БСА и 0,25 &му; М флуоресцеина модифицированный детектор зонд 2 положительный контроль датчики (используется для нормализации сигнала) и инкубируют в течение 15 мин.
- Промыть сенсорный чип деионизированной H 2 O в течение 2-3 сек и сушат под потоком азота в течение 5 секунд.
- Применение 4 мкл 0,5 Е / мл анти-флуоресцеин-HRP в 1 М фосфатного буфера, рН 7,2, содержащим 0,5% казеина к рабочему электроду всех 16 датчиков и инкубируют в течение 15 мин. Анти-флуоресцеин-HRP связывается с иммобилизованными флуоресцеина модифицированных зондов детектора.
- Промыть сенсорный чип деионизированной H 2 O в течение 2-3 сек и сушат под потоком азота в течение 5 секунд.
- Нанесите слой также наклейку на поверхности чипа датчика и нагрузки в держателе датчика чипа. 50 мкл субстрата ТМВ на все 16 датчиков и закрыть держателе датчика чипа.
- Получить амперометрии и измерения циклической вольтамперометрии для всех 16 датчиков, использующих Helios Chip Reader. Амперометрические тока пропорциональна скорости TMB ГОбразование на поверхности датчика (см. рисунок 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Опишем электрохимический анализ, который имеет конструкцию, подобную сэндвич-ELISA. Как показано на рисунке 1, задача рибосомальной РНК (рРНК) гибридизации с захватом и детектор зондов разработан окислительно-восстановительной реакции, катализируемой конъюгированное с HRP антифлуоресцентного фрагменты антител, которые связываются с 3 'связь флуоресцеин на детекторе зонда. Важной составляющей анализа чувствительности химии поверхности золотого электрода. Мы обнаружили, что тройной монослой, состоящий из тиолированным зондами захвата, mercaptohexanol и hexanedithiol значительно улучшает отношение сигнал-шум за счет снижения неспецифического фонового связывания репортерного белка 3. Анализы, описанные здесь, используют GeneFluidics 16 Датчик массива чипов показано на рисунке 2. Каждый из датчиков в решетке содержать три электрода, работа, ссылки, и вспомогательный, которые имеют точки контакта на краю чипа 4. Чип читатьэр имеет пого контакты, которые соединяются с каждой из точек контакта. Считывания чип служит интерфейсом для решетки датчиков с помощью потенциометра управляется компьютером алгоритма.
Примеры электрохимический датчик тока показаны на рисунке 3. Протекание тока в датчиках искусственно высоким в течение первых нескольких секунд после амперометрического измерения начинается из-за накопление окисленного субстрата в течение времени от применения TMB к поверхности датчика для инициирования читатель алгоритма. Текущий расход быстро достигает стабильного состояния и точные показания датчика может надежно быть получены в течение шестидесяти секунд. Датчик анализов, как правило, выполняется в двух экземплярах в качестве внутреннего контроля для датчика изменчивости. Мы обнаружили, что сенсор-датчик изменчивость является относительно постоянным, так что можно выполнять 16 различных анализов датчик параллельно на GeneFluidics 16-матричный датчик чипа. Положительные и отрицательные контрольные образцы Эссенепространственной. В качестве положительного контроля, мы включаем синтетический "моста" ДНК олигонуклеотид, который гибридизуется с обеих захвата и датчики пламени и служит в качестве синтетических мишень с известной концентрацией. Таким образом, результаты, полученные с использованием мостиковых олигонуклеотидов функции в качестве внутреннего контроля калибровки, чтобы минимизировать чип-стружка вариации.
При тестировании захвата и детектор зондов, предел обнаружения должно быть определено посредством серийных разведений образца с известной концентрацией. Как показано на рисунке 4, существует линейный логарифмическом корреляция между концентрацией образца и выход сигнала в динамическом диапазоне анализа. Предел обнаружения определяют как концентрацию целевого необходимых для формирования сигнала, 3,29 стандартных отклонений выше средней фоновых сигналов 5. Для идентификации бактерий в неизвестном образце, панель соответствующего захвата и пары детекторов зонда будут выбраны. Выбор зондов яс определяется типами бактерий, подозреваемых в конкретном типе образца. Конечно, необычные бактерии могут иногда быть найден ни в одном образце, поэтому мы рекомендуем эубактериальные пары зондов быть включены, который имеет потенциал для гибридизации с консервативными областями рРНК от любых бактерий. Рисунке 5 показаны репрезентативные результаты для образцов, содержащих E. палочки и К. пневмонии, которые часто обнаруживаются в моче больных с инфекцией мочевыводящих путей. Сигналы для большинства из датчиков будет низкой и тому подобное, и эти отрицательные результаты могут быть объединены в качестве фонового сигнала.
Рисунок 1. Принципиальная схема анализа электрохимических датчиков. Золотой электрод покрыт mercaptohexanol и hexanedithiol и функциональных добавлением тиолированными олигонуклеотида захвата зондов (синий). Сэндвич чybridization из 16S рРНК мишень с захватом ДНК олигонуклеотидного зонда и меченого флуоресцеином олигонуклеотид ДНК детектор зонд (красный), приводит к сложной который обнаруживается добавлением анти-флуоресцеин - пероксидазой хрена (HRP) конъюгата и субстрата ТМВ. Амперометрические текущего порождена окислительно-восстановительного цикла, что результаты от окисления ТМБ по HRP и сокращение TMB электронов от электрода.
Рисунок 2. . Бактериальные матричный датчик идентификации и чип крепление Каждый датчик в матрице состоит из трех электродов: центральный рабочий электрод, периферический электрод сравнения и вспомогательный электрод для стабилизации сигнала. Рабочих электродов каждого датчика в массиве функционализированных панель захвата зондов, специфичных для видов бактерий интерес (см. таблицу 3), как мы LL, как ЕС (эубактерий) захвата зонда, который гибридизуется всех бактериальных 16S рРНК молекул и Brol "преодоление" олигонуклеотида, который функционирует в качестве положительного контроля для сигнала калибровки. Сигнал измеряется путем размещения массива в чипе читателя с Pogo контактов, которые взаимодействуют с датчиком точках контакта электрода.
Рисунок 3. Амперометрические выходного тока во время измерения. Амперометрические ток измеряется параллельно для всех 16 датчиков в решетке. Текущий расход изначально крайне негативно из-за накопления окисленный субстрат ТМВ до подключения массива к чипу читателя и началом измерения. После этого текущее быстро стабилизируется и показания датчиков учитываются по 60 сек. Электроды с большим отрицательным током имеют самую высокую сигналов.
"Рисунок 4" SRC = "/ files/ftp_upload/4282/4282fig4.jpg" />
Рисунок 4. Серийный десятикратное разбавление E. палочки для определения предела обнаружения. Датчики испытывались в дубликате с серийными разведениями десятикратный известной концентрации E. палочка лизата. Наблюдаемые показания сигнала, построенные как черные круги, были использованы для прогнозирования идеализированной кривой сигнала. Объединенные стандартное отклонение для всех репликации и фоновый сигнал на самом низком целевой концентрации были использованы для вычисления предела обнаружения (синяя линия), определяемый как 3,29 стандартных отклонений над фоном.
Рисунок 5. Представитель электрохимический сенсор результатов анализа для кишечной палочки и клебсиеллы пневмонии. E. палочки и К. pneumonМИА испытывали на реактивность с зондом пар, описанных в таблицах 2 и 3. Реакционная с парой зондов KE отличает К. пневмонии из E. палочки. преодоление олигонуклеотида (Brol) выступает в качестве положительного контроля и внутреннего стандарта калибровки.
| Зонд Имя | Субъединицы рибосомы и расположение * | Последовательность |
| KE Cap 10м | 16S 74 | 5'-S-AGCTCTCTGT |
| KE Det 11м | 16S 63 | 5'-GCTACCGYTCG-F |
| EK Cap 15м | 23S 1492 | 5'-AGCCTTGATTTTCCG-S |
| EK Det 15м | 23S 1507 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| El Cap 17м | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAAAAGGTACCG-S |
| El Cap 18м | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAADAAGGTACCG-S |
| EL Det 15м | 23S 1492 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EB Cap 23м | 16S 1275 | 5'-S-ACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCT |
| EB Det 23м | 16S 1252 | 5'-CGCGAGGTCGCCTTCCTTTGTAT-F |
| PM Cap 15м | 16S 183 | 5'-S-TTTGGTCCGTAGACA |
| PM Det 17м | 16S 166 | 5'-TTATGCGGTATTAGCCA-F |
| PA Cap 11м | 16S 453 | 5'-S-ACTTACTGCCC |
| PA Det 14м | 16S 439 | 5'-TTCCTCCCAACTTA-F |
| ЕС GN Cap 19m | 16S 1502 | 5'-S-GTTCCCCTACGGTTACCTT |
| ЕС Det 18м | 16S 1484 | 5'-GTTACGACTTCACCCCAG-F |
| ЕС Brol 37m | 5'-CTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAAC |
Таблица 2. ДНК олигонуклеотидного зонда пара последовательностей. Захват (Cap) Зонды синтезировали с тиолом связи (S). Детектор (Det) Зонды синтезировали с флуоресцеином (F) модификаций. Следует отметить, что зонд пары включать либо 5'-тиолированным зонд захвата и 3'-флуоресцеин-модифицированный детектор зонда или 3'-тиолированным захвата зонда и 5'-флуоресцеин-модифицированный детектор зонда. Два зонда EL захвата смешиваются перед использованием. Чтобы упростить анализ, детектор зонды могут быть применены к каждому датчику в виде смеси без значительной перекрестной реактивности. KE - Klebsiella и Enterobacter, EK - E.coli и К. пневмонии, EL - E. клоаки, EB - Enterobacteriaceae семье, PM - P. Mirabilis, Пенсильвания - P. палочки, ЕС - эубактериальные, Brol - Преодоление олигонуклеотида. * - Местонахождение Nумбра относится к расстоянию от начала 16S или 23S гена.
| Видов бактерий | Реактивная Пары Probe |
| Кишечная палочка | EK + EB |
| Клебсиелла пневмонии | KE + EK + EB |
| Proteus Mirabilis | PM + EB |
| Синегнойной палочки | Пенсильвания |
| Enterobacter виды | KE + EB или EL + EB или KE + + EL EB |
Таблица 3. Признание видов бактерий самого зонда парах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ электрохимический сенсор описанный здесь позволяет быстрое обнаружение нуклеиновых кислот-мишеней. Чувствительность и специфичность зависеть частично от свободной энергии мишень-гибридизации с зондом, который, в свою очередь, зависит от длины и GC содержание захвата и детектор зондов. Мы обычно выполняют гибридизации шагов при комнатной температуре (~ 20 ° C) 5, 6. Однако гибридизации шагов (3.2 и 3.3) также может быть выполнена при более высоких температурах в печи гибридизации если чип помещают в закрытой камере, содержащей увлажненную фильтровальную бумагу, чтобы предотвратить испарение 7, 8. Оптимальное сигнал получают с захватом-детектор зонд пар, которые гибридизуются с соседних участков на целевой нуклеиновой кислоты без зазора между участках гибридизации 8. Это усиление сигнала, как полагают, работают пар оснований и укладки за счет увеличения гибридизации доступность смежных областей, известный как "вспомогательный зонд" эффект. Capture-детектор проблемаэлектронной гибридизации с соседними узлами также важно, потому щелочного лизиса бактерий приводит к фрагментации целевой рРНК 5. Этот метод может быть применен к обнаружению или РНК или ДНК цели, с широким спектром клинических и научных исследований. Например, она должна быть возможность использовать этот метод для изучения клеточных функций, которые регулируются малых РНК или для обнаружения антибиотик цели ген устойчивости либо как ДНК или мРНК. Предварительно amplication может быть необходимо обнаруживать цели присутствуют в небольшом количестве копий. Кроме того, ингибиторы РНКазы должны быть добавлены в процессе подготовки образца для предотвращения деградации потенциально нестабильные цели РНК.
Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами обнаружения и идентификации бактерий. Стандартной клинической микробиологии методы требуют бактериального роста на агаровой среде для количественного и применение методов идентификации. Рост бактерий на видимые колонии обычно включаетинкубации в течение ночи значительно задерживает время от сбора образцов отчитываться о результатах. Существует большой интерес к развитию более быстрых, молекулярные методы обнаружения патогенов, в том числе электрохимических биосенсоров 9. Тем не менее, мало внимания было уделено производительности ДНК-биосенсоры в сыром биологических образцов. Анализ электрохимический датчик описанные здесь, могут быть выполнены непосредственно на сыворотки и мочи без значительной потери чувствительности 7. Использование тиолированным зонды захвата и смешанный монослой описанные здесь делает поверхность датчика устойчивы к неспецифической абсорбции белка, сохраняя чувствительность в сырье биологических образцов, включая сыворотке или моче 10. В качестве всего лишь один бактериальных клеток на датчик (250 бактерий на миллилитр) могут быть обнаружены, что сравнимо с чувствительностью ПЦР-амплификации 1. Несколько основе ПЦР методы идентификации бактериальных были описаны 11, 12. Хотя ПЦР может обнаружить потенциально меньшим молекул-мишеней, чем анализ электрохимических датчиков, описанных здесь, на основе ПЦР методы достигли ограниченное принятие из-за высокой приобретение оборудования и / или стоимости реагентов, по сравнению со стандартными клиническими методами микробиологии. В противоположность этому, электрохимические датчики являются относительно недорогими в производстве. Несмотря на то, электроды изготавливают путем напыления золота, количество золота на чип является низкой, поскольку электродом толщина составляет всего 1000 ангстрем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы являются изобретателями на патенты, имеющие отношение к методам, описанным. Один из этих патентов была лицензирована для Qvella Corporation. BMC и ДАХ имеют доли участия в Qvella Corporation. В.Г. является президентом GeneFluidics, которая является производителем массива чипов электрохимический датчик, чип гору, и чип читателя описанные в этой статье.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Совместная премия AI075565 Соглашения (в ПРЗ) из Национального института аллергии и инфекционных заболеваний и Венди и Кен Рубин фонда за высокое качество исследований в области педиатрии в урологии. BMC является Джудит и Роберт Уинстон кафедра детской урологии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. | |||
References
- Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification. Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).
- Halford, C., et al. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform. Antimicrob. Agents Chemother. 56, In Press (2012).
- Campuzano, S., et al. Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples. Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).
- Gau, V., et al. Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification. Methods. 37, 73-83 (2005).
- Patel, M., et al. Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens. J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).
- Mastali, M., et al. Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature. J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).
- Liao, J. C., et al. Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens. J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).
- Liao, J. C., et al. Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection. J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).
- Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms. Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).
- Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples. Talanta. 85, 1330-1337 (2011).
- Ecker, D. J., et al. Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology. Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).
- Casalta, J. P., et al. Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).
