Bakteriell Detection & identifiering med elektrokemiska sensorer

Summary

Vi beskriver en elektrokemisk metod sensor analys för snabb bakteriell detektion och identifiering. Analysen omfattar en sensor array med funktionella fånga DNA oligonukleotidsonder för ribosom RNA (rRNA) artspecifika sekvenser. Sandwich hybridisering av mål-rRNA med infångningsproben och en pepparrotsperoxidas-länkad DNA oligonukleotid detektorsonden ger en mätbar amperometriskt ström.

Abstract

Elektrokemiska sensorer används ofta för snabb och noggrann mätning av blodglukos och kan anpassas för detektion av en mängd olika analyter. Elektrokemiska sensorer fungerar genom att överföra en biologisk erkännande händelse till en användbar elektrisk signal. Signaltransduktion sker genom koppling av aktiviteten av ett redox-enzym till en amperometrisk elektrod. Sensor specificitet är antingen en inneboende egenskap av enzymet, glukosoxidas i fallet med en glukossensor, eller en produkt av bindning mellan enzymet och en antikropp eller prob.

Här beskriver vi en elektrokemisk metod sensor analys för att direkt upptäcka och identifiera bakterier. I varje fall de sonder som beskrivs här är DNA-oligonukleotider. Denna metod är baserad på sandwich-hybridisering av avskiljning och detektor sonder med målet ribosom RNA (rRNA). Den infångande sonden är förankrad till sensorytan, medan detektorn sonden är kopplad till horseradish peroxidas (HRP). När ett substrat, såsom 3,3 ', 5,5'-tetrametylbensidin (TMB) sätts till en elektrod med capture-target-detektor komplexen bundna till dess yta är substratet oxideras av HRP och reduceras av arbetselektroden. Denna redox körcykelresultat i shuttling av elektroner av substratet från elektroden till HRP, producerar strömflöde i elektroden.

Introduction

Använda rRNA som en målmolekyl för bakteriell detektion och identifiering har ett antal fördelar. Överflödet av rRNA i bakterieceller föreskrivs en känslighetsgräns så lite som 250 bakterier per milliliter utan behov av målamplifiering ^1. Bakteriell rRNA innehåller unika artspecifika sekvenser som är tillgängliga för hybridisering med DNA-sonder. Följaktligen kan en uppsättning av elektrokemiska sensorer användas för att identifiera okända bakterier, där varje sensor är funktionaliserad med en annan artspecifik infångningsprob. Positiva-sensorer bör ingå för en syntetisk oligonukleotid mål som "broar" avskiljning och sonder detektor för att skapa en intern kalibrering signal.

Elektrokemiska sensorer har ett brett utbud av bastjänster och translationell forskning tillämpningar. Till exempel beskrivs analysen här har använts för att exakt mäta effekten av E. coli tillväxtfas på rrnA och pre-rRNA kopiera nummer, vilket är av stort intresse för forskare som är intresserade av bakteriell fysiologi ^2. Känsligheten hos elektrokemiska sensorn analysen bestäms av signal-brusförhållandet. En mängd olika signalförstärkning och buller metoder minskning har utforskats. Vi finner att förbättra kemi sensorytan är nyckeln till att minska ospecifik bindning av detektorsonden och / eller HRP enzymet. I synnerhet, har en blandad monolager av alkanedithiols och mercaptohexanol befunnits reducera bakgrunden genom att täcka elektroden ytan mer fullständigt bibehållen tillgänglighet infångningsproben för mål hybridisering ^3. Dessa ytkemi behandlingar är särskilt viktigt för analyser som inbegriper komplexa biologiska prover.

Protocol

Ett. Funktionalisering av elektrokemiska sensorer Förbered tiolerade infångningsproben vid en koncentration av 0,05 pM i 300 ^ M 1,6-hexanditiol (HDT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA och inkubera i mörker vid rumstemperatur under 10 min . Inkubation av tiolerade infångningsproben med HDT säkerställer att tiolgruppen på infångningsproben reduceras, vilket resulterar i mer konsekventa resultat. Applicera en kväveström för att nakna guld 16 sensoruppsättning chip (er) för 5 …

Representative Results

Vi beskriver en elektrokemisk analys som är strukturerad på liknande sätt som en sandwich-ELISA. Såsom visas i figur 1, mål-ribosomalt RNA (rRNA) hybridisering med avskiljning och detektor prober är framtagen av ett redox-reaktion katalyserad av HRP konjugerad till anti-fluorescein-antikroppsfragment som binder till 3'-fluorescein länksystem på detektorn sonden. En viktig komponent i analyskänsligheten är ytkemin hos guldelektroden. Vi har funnit att en ternär monoskikt bestående av tiol…

Discussion

Den elektrokemiska sensorn analys som beskrivs här möjliggör snabb upptäckt av nukleinsyramål. Känslighet och specificitet beror delvis på den fria energin för mål-sondhybridisering, vilket i sin tur beror på längden och GC-halten av avskiljning och sonder detektor. Vi utför typiskt hybridiserings stegen vid omgivande temperatur (~ 20 ° C) ^{5, 6.} Däremot kan hybridisering stegen (3.2 och 3.3) även genomföras vid högre temperaturer i en hybridiseringsugn om chipset placeras i en täckt kammare …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
6-mercapto-1-hexanol (MCH)	Sigma	451088	Store at room temperature
1,6-hexanedithiol (HDT)	Sigma	H-12005	Store at room temperature
Thiolated capture probes	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Fluorescein-modified detector probes	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Bridging Oligonucleotide	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments	Roche	11 426 346 910	Store at 4 °C
Helios Chip Reader	GeneFluidics	GFR-2009
Sensor Chip Mount	GeneFluidics	GFR-003
Film well sticker	GeneFluidics		Shipped with sensor chips
Bare gold 16-sensor array chips	GeneFluidics	SC1000-16X-B	Store in 100% N2 at room temperature
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906	Store at 4 °C
1M Phosphate Buffer, pH 7.2			0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2
Blocker Casein in PBS	Pierce	37528	Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C
			Table 1. Reagents and Equipment.