Summary
Phase-shift nanoemulsions (PSNE) kan fordampet ved hjelp av høy intensitet fokusert ultralyd for å forbedre lokal oppvarming og bedre termisk ablasjon i svulster. I denne rapporten er utarbeidelse av stabile PSNE med en smal størrelsesfordeling beskrevet. Videre er effekten av fordampede PSNE på ultralyd-mediert ablasjon demonstrert i vev-etterligne fantomer.
Abstract
Høy intensitet fokusert ultralyd (HIFU) brukes klinisk til termisk ablate svulster. For å forbedre lokal oppvarmning og forbedre termisk ablasjon i tumorer, har lipid-belagt perfluorocarbon dråper blitt utviklet som kan fordampes ved HIFU. Blodkar i mange svulster er unormalt lekk på grunn av sin raske vekst, og nanopartikler er i stand til å trenge gjennom fenestrations og passivt akkumuleres i svulster. Således kan kontrollere størrelsen av dråpene resultere i bedre akkumulering i tumorer. I denne rapporten er utarbeidelse av stabile dråper i en fase-shift nanoemulsion (PSNE) med en smal størrelsesfordeling beskrevet. PSNE ble syntetisert ved sonicating en lipidoppløsningen i nærvær av flytende perfluorkarbonene. En smal størrelsesfordeling ble oppnådd ved å ekstrudere de PSNE flere ganger ved hjelp av filtre med porestørrelser på 100 eller 200 nm. Størrelsesfordelingen ble målt over en 7-dagers periode ved hjelp av dynamisk lysspredning. Polyacrylamide hydrogeler inneholder PSNE var forberedt på in vitro eksperimenter. PSNE dråper i hydrogeler ble fordampet med ultralyd og de resulterende bobler forbedret lokalisert oppvarming. Fordampede PSNE muliggjør raskere oppvarming og reduserer også ultralyd intensitet er nødvendig for termisk ablasjon. Dermed er PSNE forventes å øke termisk ablasjon i svulster, potensielt forbedre terapeutiske utfall av HIFU-medierte termisk ablasjon behandlinger.
Protocol
1. Utarbeidelse av fase-shift nanoemulsion (PSNE)
- Oppløs 11 mg DPPC og 1,68 mg DSPE-PEG2000 i kloroform
- Fordamp det organiske oppløsningsmiddel for å danne en tørr lipidfilm i et glass rundkolbe
- Dessicate lipid film over natten
- Rehydrere lipidfilmen med 5,5 ml fosfat-bufret saltvann (PBS)
- Heat oppløsning i et 45 ° C vannbad inntil lipidfilm oppløses, vortexblanding periodisk
- Overfør lipidoppløsningen inn 7 ml hetteglass
- Sonicate lipidoppløsningen i 2 min ved 20% amplitude
- Dele løsningen i to ampuller med 2,5 ml i hver (forkast resterende 0,5 ml)
- Legg 2,5 ml PBS til hver ampulle
- Plassere hver ampulle i en 0 ° C is-vannbad
- Tilsett 50 pl DDFP til hver ampulle
- Sonicate hvert hetteglass i isbad ved hjelp av følgende innstillinger: 25% amplitude, pulset modus (10 sek på, 50 sek av), 60 sek totalt på tide
- Transfer PSNE løsninger til 20 ml scintillasjonsglass
- Tilsett 5 ml PBS til hver brønn, som resulterer i 10 ml sluttvolum
- Monter extruder følgende forskrifter gitt av produsenten
- Skyll hver del med avionisert vann
- Plasser den rustfrie støtte plate i sentrum av filteret støttebasen
- Plasser rustfritt stålnett på toppen av det rustfrie stål-støtte-plate
- Ved hjelp av pinsett, plasserer en ekstruder avløp plate membran (den blanke siden opp) på rustfritt stål mesh
- Ved hjelp av pinsett, plasserer ekstruderen filter (blanke siden opp) på drain platen membran
- Plasser den lille O-ringen på filteret og legg thermobarrel og extruder toppen over støttebasen
- Delvis trekkes hver vinge-mutter først, deretter helt stram vingemuttere for hånd i et vekslende mote
- Koble ekstruder tilen nitrogengasstrøm linje
- Å prime ekstruder, pipette 10 ml avionisert vann inn i toppen prøven port, cap åpningen, og stram lufteventilen
- Åpne sakte nitrogengass linje for å øke trykket, tvinge prøven gjennom membranene, og samle prøven fra uttaket slangen
- Etter bruk, demontere i omvendt rekkefølge, skyll ekstruderen delene med deionisert vann, og kast membranfilteret og membran avløp plate
- For 100 nm dråper bare, forutsetning PSNE ved ekstrudering 10 ganger gjennom 200 nm filter
- Extrude PSNE 16 ganger gjennom 100 nm eller 200 nm filter for å oppnå smal størrelsesfordeling
2. Utarbeidelse av Polyacrylamide Hydrogel inneholder PSNE
- Forbered 24% BSA-løsning ved å fortynne 1,2 g BSA pulver i 5 ml avionisert vann
- Forbered 10% APS løsning ved utvannet 0,1 g APS pulver i 1 ml avionisert water
- I følgende rekkefølge, bland 2,1 ml akrylamid oppløsning, 1,2 ml Tris-buffer, 0,1 ml 10% APS, 4,5 ml 24% BSA-løsning, og 3,6 ml deionisert vann i plastkammer
- Varm opp til 40 ° C og plasser under vakuum i 1 time
- Legg 480 ul PSNE og blandes ved forsiktig virvlende plast kammer.
- Tilsett 12 pl TEMED og plassere kammeret i en 12 ° C vannbad i 2 timer
3. Representant Resultater
En skjematisk av oppsettet for ultralyd eksperimenter med vev-etterligne hydrogel fantomer er vist i figur 1. Denne protokollen resulterer i lipid-belagte perfluorocarbon dråper med en smal størrelsesfordeling som er stabile i løsning i minst en uke. Størrelsesfordelingen målt med dynamisk lysspredning (90Plus partikkelstørrelse analysator, Brookhaven Instruments, Holtsville, NY) er vist i figur 2 for PSNE ekstrudert ved anvendelse av 100 og 200nm filtre. Den PSNE effektiv diameter over tid, målt ved hjelp av dynamisk lysspredning, er oppført i tabell 1, viser at PSNE er stabile i minst en uke. B-mode bilder av PSNE før og etter fordamping i en polyakrylamid hydrogel er vist i figur 3. Også, en lesjon dannet av 15 sek av HIFU-mediert oppvarming i en polyakrylamid hydrogel inneholdende albumin og PSNE er vist i Figur 4. Den asymmetriske formen på lesjonen er et resultat av prefocal oppvarming som skjer på grunn av tilstedeværelsen av boblen skyen i ultralyd banen. Det er viktig å merke seg at prefocal oppvarming og lesjonsdannelse grunnet strø fra bobler kan minimeres ved å redusere den overførte akustiske strøm.
Figur 1. Skisse av eksperimentelt oppsett for ultralyd eksperimenter med vev-mimicking hydrogeler.
Figur 2. Størrelse fordeling av PSNE ekstrudert gjennom 100 nm eller 200 nm filtre, målt ved hjelp av dynamisk lysspredning. Enhetene av ordinaten aksene er basert på intensiteten av spredt lys fra partikler av en viss størrelse i forhold til den totale spredte lysintensiteten fra prøven.
Figur 3. B-mode bilder (a) før og (b) etter PSNE fordamping i en polyakrylamid hydrogel. Pilen viser fokalregion der en boble sky ble dannet av PSNE fordamping.
Figur 4. Bilder av polyacrylamide hydrogel inneholdende albumin og PSNE (a) før og (b) etter fordamping og sonikering med HIFU, demonstrere lesjon formasjon som et resultat av ultralyd-indusert oppvarming. Ultralyd senterfrekvens var 3,3 MHz. Ultralyd signal besto av en innledende 30-syklus, 6,4 W puls å fordampe PSNE, umiddelbart etterfulgt av 15 sek kontinuerlig ultralyd ved 0,77 W.
| Dager etter ekstrudering | Ekstrudert med 200 nm filter | Ekstrudert med 100 nm filter | ||
| Mener Dia. (Nm) | Std. Dev. (Nm) | Mener Dia. (Nm) | Std. Dev. (Nm) | |
| 1 | 182,9 | 4.9 | 118,0 | 0.9 |
| 7 | <td> 177,72.5 | 124,8 | 3.1 | |
Tabell 1. Mean diameter og standardavvik PSNE på ett og sju dager etter ekstrudering med 100 nm og 200 nm filtre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Høyintensitets fokusert ultralyd (HIFU) brukes klinisk til termisk ablate svulster. 1 For å forbedre lokal oppvarmning og forbedre termisk ablasjon i tumorer, har lipid-belagt perfluorocarbon dråper blitt utviklet som kan fordampes ved HIFU. Blodkar i mange tumorer er unormalt utett på grunn av deres raske vekst. 2 Dermed nanopartikler er i stand til å trenge gjennom fenestrations og passivt akkumuleres i tumorer, en prosess kjent som forbedret permeabilitet og retensjon (EPR) effekt. 3 Det har vist seg at nanopartikler mellom 70 og 200 nm akkumulerer mest effektivt i svulster. 4 Fremgangsmåten beskrevet i denne rapporten gir en stabil fase-skift nanoemulsion (PSNE) av lipid-belagte perfluorocarbon dråper med en smal størrelsesfordeling. I det siste har de fleste studier brukt polydisperse størrelse distribusjoner av PSNE, men nyere studier fokusert på å produsere PSNE med smale størrelse distribusjoner.5, 6 Ekstruderingsteknikken metoden beskrevet i denne protokoll tillater en å kontrollere størrelsen for å øke andelen av dråper administreres systemisk som vil akkumuleres i tumorer.
Den dodecafluoropentane kjerne av nanodroplets har en koketemperatur på 29 ° C. 7 Således er det viktig å opprettholde en lav temperatur i løpet av hvert trinn av PSNE forberedelse. Sonikering øker temperaturen av løsningen, men ved anvendelse av en pulset sonikering sekvens og plassere prøven i et is-vann-bad under sonikering kan redusere fordampning. Når lipid-belagte dråper har dannet, øker den kokende temperatur over 60 ° C på grunn av overflatespenningen. 8 PSNE Fordampingsanlegg er temperatur-og trykk-avhengige og også avhengig av størrelsen og sammensetningen av de flytende perfluorocarbon dråper. 9 For eksempel ble det funnet at peak fortynningstrykk trykk over 3,8 MPa var nødvendig for å fordampe 200nm DDFP dråper ved 37 ° C. 10 Belegg dråpene med lipider konjugert med poly (etylenglykol) (PEG) hemmer fusion, og dermed øke størrelsen stabiliteten PSNE over flere dager. I tillegg har det blitt dokumentert at PEG kan øke sirkulasjonstid av lipid-baserte vesikler, 11-13 som kan øke fraksjonen av systemisk administrert PSNE som akkumuleres i lokaliserte maligniteter. 14, 15
De perfluorocarbon dråpene kan være opphengt i et vev-etterligne polyakrylamid hydrogel fantom inneholdende albumin for in vitro termisk ablasjon studier. 16 De PSNE-loaded hydrogeler er nyttige for å vurdere fordampningskammeret terskler samt studier lesjonsdannelse fra boble-forbedret HIFU-mediert oppvarming . Hydrogelene absorbere og omdanne akustisk energi til varme, og når temperaturen i hydrogel overskrider 58 ° C, albumin i hydrogel denatures og blir ugjennomsiktig. 17 Fordi hydrogeler er optisk transparent, er det mulig å observere proteindenaturering i sanntid. Fordamping av PSNE innenfor hydrogeler skaper bobler, som brukes til å øke effektiviteten av ultralyd-mediert oppvarming. Ved hjelp av en fokusert svinger PSNE fordamping og boble-forbedret oppvarming kan være lokalisert, og dermed unngår uønsket oppvarming i mellomliggende biologiske medier (dvs. vev). I fantomer, kan det fordampede boble skyen påvirker ultralydstrålen forplantning og forårsake prefocal oppvarming, forutsatt at akustisk effekt overstiger en terskel. Under denne terskelen, er spredt strøm for lavt til ablate vev i prefocal regionen, derfor, er ablated volumet begrenset til plasseringen av boble skyen. Bruken av PSNE å forbedre lokal oppvarming in vivo potensielt kan forbedre resultatene av HIFU tumor ablasjon terapi. Som et første steg, har en ekstrudering-basert protokoll blitt utviklet for å kontrollerestørrelsen på snevert distribuert PSNE. Bruke PSNE dispergert innenfor optisk transparente vev-etterligne hydrogeler, er det mulig å undersøke virkningen av fordampede PSNE på ultralyd-mediert oppvarming og termisk ablasjon. Levering av terapeutiske midler og nanopartikler til svulsten kjernen in vivo er fortsatt en utfordring på grunn av økte interstitielle press som er funnet der. Det er sannsynlig at PSNE ville fortrinnsvis akkumuleres i svulsten periferien og kan ikke lett trenge inn i svulsten kjerne. Studier i hydrogeler har vist at bobler kan omdirigere akustisk energi mot svingeren resulterer i ablated volumer i prefocal regionen. Dette skjer når den overførte akustiske strømmen overstiger en bestemt terskel. Således, er det mulig å lokalisere boble-forbedret tumor ablasjon til svulsten periferien ved hjelp av én effektinnstilling samt ablate indre kjernen ved å reflektere akustisk energi fra bobler opprettet i distal margen på et høyere power innstillingen. Videre ville presis ablasjon av svulsten periferien som unngår skade omkringliggende friskt vev fortsatt representerer et betydelig gjennombrudd og potensielt kan tillate tidligere ikke resectable tumorer fjernes kirurgisk. Selv om det er forskjeller mellom in vivo forhold og vev-etterligne hydrogeler, fantomene er nyttige for å forstå de fysiske mekanismene for ultralyd forbedret oppvarming med PSNE for å optimalisere ultralyd parametere for termisk ablasjon. Dette er viktige skritt for å oversette bruk av PSNE for å styrke ultralyd-mediert ablasjon fra laboratoriet til klinikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en BU / CIMIT Applied Healthcare Engineering Predoctoral Fellowship, en National Science Foundation Utvide Deltakelse Forskning Initiation Grant i Engineering (Brige), og National Institutes of Health (R21EB0094930).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPPC | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine |
| DSPE-PEG2000 | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 880120P | 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) |
| DDFP | Fluoromed, Round Rock, TX, USA | CAS: 138495-42-8 | Dodecafluoropentane (C5F12) |
| PBS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P2194 | Phosphate-buffered saline |
| Chloroform | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 372978 | Chloroform |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9926 | 40% 19:1 acrylamide/bis-acrylamide |
| Tris buffer | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T2694 | 1M, pH 8, trizma hydrochloride and trizma base |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3059 | Bovine serum albumin |
| APS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3678 | Ammonium persulfate solution |
| TEMED | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 87689 | N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine |
| Equipment | |||
| Sonicator (3 mm tip) | Sonics Materials, Inc., Newtown, CT, USA | Vibra-Cell | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Neslab EX-7 | |
| Extruder | Northern Lipids, Burnaby, BC, Canada | LIPEX | |
| Extruder Filters | Whatman, Piscataway, NJ, USA | Nuclepore #110605 and #110606 | |
| Extruder Drain Disc | Sterlitech Corporation, Kent, WA, USA | #PETEDD25100 | |
| Plastic chamber | U.S. Plastic Corporation, Lima, OH, USA | #55288, 1 3/16"x1 3/16"x2 7/16" | |
References
- Hynynen, K., Darkazanli, A., Unger, E., Schenck, J. F.
- Baban, D. F., Seymour, L. W.
- Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J. Control. Release. 65, 271-284 (2000).
- Schadlich, A. Tumor accumulation of NIR fluorescent PEG-PLA nanoparticles: impact of particle size and human xenograft tumor model. ACS Nano. 5, 8710-8720 (2011).
- Williams, R. Convertible perfluorocarbon droplets for cancer detection and therapy. 2010 IEEE Ultrasonics Symposium. , (2010).
- Martz, T. D., Sheeran, P. S., Bardin, D., Lee, A. P., Dayton, P. A. Precision manufacture of phase-change perfluorocarbon droplets using microfluidics. Ultrasound Med. Biol. 37, 1952-1957 (2011).
- Giesecke, T., Hynynen, K. Ultrasound-mediated cavitation thresholds of liquid perfluorocarbon droplets in vitro. Ultrasound Med. Biol. 29, 1359-1365 (2003).
- Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. Formulation and Acoustic Studies of a New Phase-Shift Agent for Diagnostic and Therapeutic Ultrasound. Langmuir. 27, 10412-10420 (2011).
- Sheeran, P. S. Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging. Ultrasound Med. Biol. 37, 1518-1530 (2011).
- Zhang, P. The Application of Phase-Shift Nanoemulsion in High Intensity Focused Ultrasound: An In Vitro Study [Doctoral Dissertation]. , (2011).
- Allen, T. M., Hansen, C., Martin, F., Redemann, C., Yau-Young, A. Liposomes containing synthetic lipid derivatives of poly(ethylene glycol) show prolonged circulation half-lives in vivo. Biochim. Biophys. Acta. 1066, 29-36 (1991).
- Klibanov, A. L., Maruyama, K., Beckerleg, A. M., Torchilin, V. P., Huang, L. Activity of amphipathic poly(ethylene glycol) 5000 to prolong the circulation time of liposomes depends on the liposome size and is unfavorable for immunoliposome binding to target. Biochim. Biophys. Acta. 1062, 142-148 (1991).
- Klibanov, A. L., Maryama, K., Torchilin, V. P., Huang, L. Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes. FEBS Lett. 268, 235-237 (1990).
- Gabizon, A. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of Doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54, 987-992 (1994).
- Awasthi, V. D., Garcia, D., Goins, B. A., Philips, W. T. Circulation and biodistribution profiles of long-circulating PEG-liposomes of various sizes in rabbits. Int. J. Pharm. 253, 121-132 (2003).
- Zhang, P., Porter, T. An in vitro study of a phase-shift nanoemulsion: a potential nucleation agent for bubble-enhanced HIFU tumor ablation. Ultrasound Med. Biol. 36, 1856-1866 (2010).
- Lafon, C. Gel phantom for use in high-intensity focused ultrasound dosimetry. Ultrasound Med. Biol. 31, 1383-1389 (2005).
