Elettroencefalografia simultanea, in tempo reale misura della concentrazione di lattato e la manipolazione Optogenetic di attività neuronale nella corteccia cerebrale Rodentia
Summary
La procedura è descritta per manipolare l'attività dei neuroni cerebrali corticali piramidali optogenetically mentre l'elettroencefalogramma, elettromiogramma, e cerebrale concentrazione di lattato sono monitorati. Registrazioni sperimentali vengono eseguite su cavo-frenati topi, mentre subiscono spontanee sonno / veglia cicli. Optogenetic apparecchiatura è assemblata nel nostro laboratorio, apparecchi registrazione è commercialmente disponibile.
Abstract
Sebbene il cervello rappresenta meno del 5% della massa del corpo, utilizza circa un quarto del glucosio utilizzato dal corpo a riposo 1. La funzione del sonno non REM (NREMS), la più grande porzione di sonno da tempo, è incerto. Tuttavia, una caratteristica saliente di NREMS è una riduzione significativa nel tasso di utilizzazione del glucosio cerebrale rispetto alla veglia 2-4. Questo ed altri risultati hanno portato alla convinzione diffusa che il sonno ha una funzione relativa al metabolismo cerebrale. Tuttavia, i meccanismi alla base della riduzione del metabolismo del glucosio cerebrale durante NREMS restano da chiarire.
Un fenomeno associato NREMS che potrebbero avere un impatto tasso metabolico cerebrale è la presenza di onde lente, oscillazioni a frequenze inferiori a 4 Hz, nel elettroencefalogramma 5,6. Queste onde lente rilevate a livello del cranio o cerebrali riflettono la superficie corticaleoscillazioni dei neuroni sottostanti tra uno stato depolarizzata / e uno stato iperpolarizzato / giù 7. Durante lo stato verso il basso, le cellule non subiscono potenziali di azione per gli intervalli fino a 100 diversi millisecondi. Restauro di gradienti di concentrazione ionici successivi potenziali d'azione rappresenta un carico significativo sul metabolismo della cellula 8; assenza di potenziali d'azione verso il basso durante stati associati NREMS può contribuire ad un metabolismo ridotto rispetto a svegliarsi.
Due sfide tecniche dovevano essere affrontate per questo rapporto ipotetico da testare. Prima, è stato necessario misurare cerebrale metabolismo glicolitico con una risoluzione temporale riflettente della dinamica del EEG cerebrale (cioè, più di secondi piuttosto che minuti). Per fare ciò, abbiamo misurato la concentrazione di lattato, il prodotto della glicolisi aerobica, e quindi una lettura della velocità del metabolismo del glucosio nel cervello di topi. Lattato eramisurata con un sensore basato lattato ossidasi tempo reale incorporato nella corteccia frontale. Il meccanismo di rilevamento costituito da un elettrodo di platino-iridio circondato da uno strato di molecole di lattato ossidasi. Metabolismo del lattato dal lattato ossidasi produce perossido di idrogeno, che produce una corrente in platino-iridio elettrodo. Così un dilagare della glicolisi cerebrale fornisce un aumento della concentrazione di substrato per lattato ossidasi, che poi si riflette in un aumento di corrente all'elettrodo di rilevamento. Era inoltre necessario misurare queste variabili mentre manipolando l'eccitabilità della corteccia cerebrale, in modo da isolare la variabile da altre sfaccettature NREMS.
Abbiamo messo a punto un sistema sperimentale per la misura simultanea di attività neuronale attraverso il elecetroencephalogram, misura del flusso glicolitico tramite un biosensore lattato, e la manipolazione di attività cerebrale corticale neuronale attraverso l'attivazione optogenetic di piramideneuroni Midal. Abbiamo utilizzato questo sistema per documentare la relazione tra sonno-correlati e le forme d'onda elettroencefalografica momento per momento dinamiche di concentrazione di lattato nella corteccia cerebrale. Il protocollo può essere utile per qualsiasi individuo interessato a studiare, a comportarsi liberamente roditori, il rapporto tra attività neuronale misurata a livello elettroencefalografico ed energetica cellulari all'interno del cervello.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi qui presentati permettono di misurare la relazione tra sonno e cambiamenti nella concentrazione cervello del lattato glicolitico intermedio su una scala di tempo non possibile in precedenza. Gli animali sottoposti spontaneamente delle transizioni tra veglia, NREMS e REMS. Inoltre, siamo in grado di applicare stimoli optogenetic mentre gli animali sottoposti a queste transizioni. I dati raccolti fino ad oggi dimostrano che l'impatto sia spontanea che indotta onde sulla lettura di un lattato ossidasi a base d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca finanziata dal Dipartimento della Difesa (Defense Advanced Research Projects Agency, Premio Facoltà giovane, il codice di autorizzazione N66001-09-1-2117) e NINDS (R15NS070734).
Materials
| Component | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BASi Mouse Guide Cannula | Pinnacle Technology/BASi Inc | 7032 | |
| Lactate Biosensor | Pinnacle Technology | 7004 | |
| Head Mount | Pinnacle Technology | 8402 | |
| Sleep/Biosensor Recording system | Pinnacle Technology | 8400-K1-SL | 2 EEG channels, 1 EMG channel, & 1 biosensor |
| Tethered Mouse in-vitro Calibration kit | Pinnacle Technology | 7000-K1-T | |
| Fiber Optic Guide Cannula | Plastics One | C312G | 21 Gauge Guide Cannula |
| Dummy Cannula | Plastics One | C312DC | 21 Gauge Dummy |
| Diamond Fiber Scribe | Thorlabs | S90W | |
| Fiber Connector Crimp Tool | Thorlabs | CT042 | |
| Furcation Tubing | Thorlabs | FT030 | 03.0 mm |
| Thorlabs | T10S13 | Max Dia. 0.012 | |
| Furcation Tube Stripper | Thorlabs | FTS3 | |
| Bare Hard Cladding Multimode Fiber | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm Core, 0.37 NA |
| Wire Snips/Kevlar Shears | Thorlabs | T865 | |
| Fiber Optic Epoxy | Thorlabs | F112 | |
| Fiber Stripper Tool | Thorlabs | ||
| Glass Polishing Plate | Thorlabs | CTG913 | |
| Rubber Polishing Pad | Thorlabs | NRS913 | |
| Eye Loupe | Thorlabs | JEL10 | |
| Kim Wipes | Thorlabs | KW32 | |
| Compressed Air | Thorlabs | CA3 | |
| Polishing Puck | Thorlabs | D50-xx | |
| Fiber Inspection scope | Thorlabs | CL-200 | |
| Polishing Films | Thorlabs | LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P | |
| FC/PC connector end | Thorlabs | 30126G2-240 | 240 μm Bore, SS Ferrule |
| MC Stimulus Unit | Multi-Channel Systems | STG-4002 | |
| MC Stimulus Software | Multi-Channel Systems | MC-Stimulus V 2.1.5 | |
| Blue Laser | CrystaLaser | CL473-050-0 | |
| Laser Power supply | CrystaLaser | CL2005 | |
| Fiber Optic Rotary Joint | Doric Lenses | FRJ-v4 | |
| Table 2. Supplies and equipment. |
References
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