Summary

Eletroencefalografia simultânea, em tempo real de medição da concentração de lactato e Manipulação optogenética da atividade neuronal do córtex cerebral de roedores

Published: December 19, 2012
doi:

Summary

Um procedimento é descrito para manipular a actividade de neurónios piramidais corticais cerebrais optogenetically enquanto o electroencefalograma, electromiograma, e concentração do lactato cerebral são monitorados. Gravações experimentais são realizados em ratinhos de cabo-cativos, enquanto eles sofrem espontâneas do sono / vigília ciclos. Optogenética equipamento é montado no nosso laboratório, o equipamento de gravação encontra-se comercialmente disponível.

Abstract

Embora o cérebro representa menos de 5% da massa corporal por, utiliza cerca de um quarto da glucose utilizada pelo corpo em repouso 1. A função do sono movimento rápido dos olhos não (NREMS), a maior porção do sono pelo tempo, é incerto. No entanto, uma característica saliente do NREMS é uma redução significativa da taxa de utilização de glicose cerebral em relação ao estado de vigília 2-4. Esta e outras descobertas levaram à crença de que o sono tem uma função relacionada ao metabolismo cerebral. No entanto, os mecanismos subjacentes à redução no metabolismo da glicose cerebral durante NREMS permanecem por ser elucidados.

Um fenômeno associado com NREMS que podem afetar a taxa metabólica cerebral é a ocorrência de ondas lentas, oscilações em freqüências menos de 4 Hz, no eletroencefalograma 5,6. Estas ondas lentas detectados ao nível do crânio ou da superfície cortical cerebral reflectir aoscilações de neurônios subjacentes entre um estado despolarizado / up e um estado hiperpolarizada / baixo 7. Durante o estado para baixo, as células não sofrem potenciais de ação em intervalos de até vários milissegundos cem. Restauração dos gradientes de concentração iônica subseqüentes para os potenciais de ação representa uma carga significativa metabólica na célula 8; ausência de potenciais de ação durante os estados para baixo associados NREMS pode contribuir para um metabolismo reduzido em relação ao acordar.

Dois desafios técnicos tiveram que ser abordadas para que essa hipotética relação a ser testada. Em primeiro lugar, foi necessário medir o metabolismo glicolítico cerebral com uma resolução temporal de reflexo da dinâmica do EEG cerebral (isto é, ao longo de segundos em vez de minutos). Para o fazer, foi medida a concentração de lactato, o produto da glicólise aeróbica, e, portanto, uma leitura da taxa do metabolismo da glucose no cérebro dos ratos. Lactato foimedida utilizando um sensor de lactato-oxidase com base em tempo real, incorporado no córtex frontal. O mecanismo de detecção é constituído por um eléctrodo de platina-irídio rodeado por uma camada de moléculas de oxidase de lactato. O metabolismo do lactato pela lactato oxidase produz peróxido de hidrogénio, o qual produz uma corrente no eléctrodo de platina-irídio. Assim, uma rampa para cima da glicólise cerebral proporciona um aumento na concentração do substrato para a oxidase de lactato, que, em seguida, reflecte-se no aumento da corrente no eléctrodo de detecção. Era ainda necessário medir estas variáveis ​​enquanto manipulando a excitabilidade do córtex cerebral, a fim de isolar esta variável de outras facetas NREMS.

Criámos um sistema experimental para a medição simultânea de actividade neuronal por meio do elecetroencephalogram, a medição do fluxo glicolítico através de um biossensor de lactato, e a manipulação da actividade neuronal cortical cerebral através optogenética activação de pyraneurônios MIDAL. Foi utilizado este sistema para documentar a relação entre o sono relacionada electroencefalográfico formas de onda e a dinâmica momento-a-momento da concentração de lactato no córtex cerebral. O protocolo pode ser útil para qualquer indivíduo interessados ​​em estudar, em livremente comportando roedores, a relação entre a actividade neuronal medido ao nível EEG e energetics celulares dentro do cérebro.

Protocol

1. Preparação Cirúrgica de Animais 1. Assuntos experimentais Utilizar ratos da B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) linha transgénica 18Gfng / J 9; JAX estirpe # 7612), ou outros ratos expressando o canal de catião sensível à luz azul, channelrodopsina-2, em neurónios corticais cerebrais. Aplicação de luz azul, para o córtex cerebral do B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) linha transgénica 18Gfng / J faz com que os neurónios piramidais que expressam channelrodopsin…

Representative Results

Como mostrado na Figura 2, um mouse equipado para optogenética estimulação e lactato / EEG / EMG dados foram submetidos à coleta de transições espontâneas sono / vigília do estado enquanto EEG, EMG e concentração de lactato cerebral foram monitorados continuamente. Corrente para o sensor de lactato aumentou durante os períodos de baixa amplitude do EEG e diminuiu durante os períodos de alta amplitude EEG. Como mostrado na Figura 3, ambos os canais de…

Discussion

Os métodos aqui apresentados permitem medir a relação entre o sono e as alterações na concentração do lactato cérebro intermediário glicolítico numa escala de tempo não era possível anteriormente. Animais sofrem transições espontâneas entre vigília, NREMS e REMS. Além disso, somos capazes de aplicar estímulos optogenética enquanto que os animais submetidos a estas transições. Os dados recolhidos até à data demonstram que tanto espontânea e induzida por ondas de impacto sobre a leitura de um bioss…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Pesquisa financiada pelo Departamento de Defesa (Defense Advanced Research Projects Agency, Prêmio Faculdade Young, Grant Número N66001-09-1-2117) e NINDS (R15NS070734).

Materials

Component Company Catalogue number Comments (optional)
BASi Mouse Guide Cannula Pinnacle Technology/BASi Inc 7032  
Lactate Biosensor Pinnacle Technology 7004  
Head Mount Pinnacle Technology 8402  
Sleep/Biosensor Recording system Pinnacle Technology 8400-K1-SL 2 EEG channels, 1 EMG channel, & 1 biosensor
Tethered Mouse in-vitro Calibration kit Pinnacle Technology 7000-K1-T  
Fiber Optic Guide Cannula Plastics One C312G 21 Gauge Guide Cannula
Dummy Cannula Plastics One C312DC 21 Gauge Dummy
Diamond Fiber Scribe Thorlabs S90W  
Fiber Connector Crimp Tool Thorlabs CT042  
Furcation Tubing Thorlabs FT030 03.0 mm
  Thorlabs T10S13 Max Dia. 0.012
Furcation Tube Stripper Thorlabs FTS3  
Bare Hard Cladding Multimode Fiber Thorlabs BFL37-200 200 μm Core, 0.37 NA
Wire Snips/Kevlar Shears Thorlabs T865  
Fiber Optic Epoxy Thorlabs F112  
Fiber Stripper Tool Thorlabs    
Glass Polishing Plate Thorlabs CTG913  
Rubber Polishing Pad Thorlabs NRS913  
Eye Loupe Thorlabs JEL10  
Kim Wipes Thorlabs KW32  
Compressed Air Thorlabs CA3  
Polishing Puck Thorlabs D50-xx  
Fiber Inspection scope Thorlabs CL-200  
Polishing Films Thorlabs LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P  
FC/PC connector end Thorlabs 30126G2-240 240 μm Bore, SS Ferrule
MC Stimulus Unit Multi-Channel Systems STG-4002  
MC Stimulus Software Multi-Channel Systems MC-Stimulus V 2.1.5  
Blue Laser CrystaLaser CL473-050-0  
Laser Power supply CrystaLaser CL2005  
Fiber Optic Rotary Joint Doric Lenses FRJ-v4  
      Table 2. Supplies and equipment.

References

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Clegern, W. C., Moore, M. E., Schmidt, M. A., Wisor, J. Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex. J. Vis. Exp. (70), e4328, doi:10.3791/4328 (2012).

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