Samtidig Electroencephalography, Real-time Måling av laktat Konsentrasjon og Optogenetic Manipulering av neuronal aktivitet i Rodent Cerebral Cortex
Summary
En prosedyre er beskrevet for å manipulere aktiviteten av cerebrale kortikale pyramidale neuroner optogenetically mens electroencephalogram, elektromyogram og cerebral laktatkonsentrasjon overvåkes. Eksperimentelle opptak er utført på kabel-tethered mus mens de gjennomgår spontane søvn / våkne sykluser. Optogenetic utstyr er montert i vårt laboratorium, opptaksutstyr er kommersielt tilgjengelig.
Abstract
Selv om hjernen representerer mindre enn 5% av kroppen ved massen, benytter den omtrent en fjerdedel av den glukose som brukes av kroppen ved hvile 1. Funksjonen av ikke rapid eye movement søvn (NREMS), den største delen av søvn etter tid, er usikkert. Imidlertid er en særtrekk NREMS en betydelig reduksjon i hyppigheten av cerebral glukose utnyttelse i forhold til våkenhet 2-4. Dette og andre funn har ført til utbredt oppfatning at søvn serverer en funksjon i forhold til cerebral metabolisme. Likevel, mekanismene bak reduksjon i cerebral glukose metabolisme under NREMS gjenstår å bli belyst.
Et fenomen knyttet til NREMS som kan påvirke cerebral metabolic rate er forekomsten av langsomme bølger, svingninger på frekvenser mindre enn 4 Hz, i elektroencefalogram 5,6. Disse langsomme bølger detektert ved nivået av skallen eller cerebral kortikale overflate reflekterersvingninger av underliggende nevroner mellom en depolarized / opp staten og en hyperpolarized / ned tilstand 7. Under ned staten, ikke celler gjennomgå aksjonspotensialer i intervaller på opptil flere hundre millisekunder. Restaurering av ioniske konsentrasjon gradienter i etterkant aksjonspotensialer representerer en betydelig metabolsk belastning på cellen 8; fravær av aksjonspotensialer under ned stater forbundet med NREMS kan bidra til redusert metabolisme i forhold til å våkne.
To tekniske utfordringer måtte rettes for at denne hypotetiske forholdet som skal testes. Først var det nødvendig å måle cerebral glykolytisk metabolisering med tidsoppløsning reflekterende av dynamikken av cerebral EEG (som er, over sekunder snarere enn minutter). For å gjøre dette, har vi målt konsentrasjonen av laktat, produktet av aerobe glykolysen, og derfor en avlesning av frekvensen av glukosemetabolismen i hjernen til mus. Laktat varmålt ved hjelp av en laktat oxidase basert sanntid sensor innebygd i frontal cortex. Sensing mekanismen består av en platina-iridium elektrode omgitt av et lag av laktat oksidase molekyler. Metabolismen av laktat ved laktat oxidase produserer hydrogen peroxide, som produserer en strøm i platina-iridium elektroden. Så en gradvis oppbygging av cerebral glykolysen gir en økning i konsentrasjonen av substrat for laktat oksydase, som deretter er reflektert i økte gjeldende ved sensing elektroden. Det var i tillegg nødvendig å måle disse variablene samtidig manipulere excitability av hjernebarken, for å isolere denne variabelen fra andre fasetter av NREMS.
Vi utviklet et eksperimentelt system for samtidig måling av neuronal aktivitet via elecetroencephalogram, måling av glycolytic flux via en laktat biosensor, og manipulering av cerebral kortikale neuronal aktivitet via optogenetic aktivering av Pyramidal nerveceller. Vi har benyttet dette systemet for å dokumentere sammenhengen mellom søvn-relatert elektroencefalografiske kurver og øyeblikk til øyeblikk dynamikken i laktatkonsentrasjon i hjernebarken. Protokollen kan være nyttig for en hvilken som helst individuell interessert i å studere, i fritt oppfører gnagere, forholdet mellom neuronal aktivitet målt på elektroencefalografiske nivå og cellulære energetikk i hjernen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metodene som presenteres her tillate en å måle forholdet mellom søvn og endringer i hjernen konsentrasjonen av glykolytisk mellomliggende laktat på en tidsskala ikke tidligere var mulig. Dyr gjennomgå spontane overganger mellom vekke, NREMS og REMS. Videre er vi i stand til å anvende optogenetic stimuli mens dyr gjennomgå disse overgangene. Data innsamlet hittil viser at både spontan og induserte bølger innvirkning på avlesning av en laktat oksydase-basert biosensor.
Man kunne kons…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning finansiert av Department of Defense (Defense Advanced Research Projects Agency, Young fakultet Award, Grant Number N66001-09-1-2117) og NINDS (R15NS070734).
Materials
| Component | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BASi Mouse Guide Cannula | Pinnacle Technology/BASi Inc | 7032 | |
| Lactate Biosensor | Pinnacle Technology | 7004 | |
| Head Mount | Pinnacle Technology | 8402 | |
| Sleep/Biosensor Recording system | Pinnacle Technology | 8400-K1-SL | 2 EEG channels, 1 EMG channel, & 1 biosensor |
| Tethered Mouse in-vitro Calibration kit | Pinnacle Technology | 7000-K1-T | |
| Fiber Optic Guide Cannula | Plastics One | C312G | 21 Gauge Guide Cannula |
| Dummy Cannula | Plastics One | C312DC | 21 Gauge Dummy |
| Diamond Fiber Scribe | Thorlabs | S90W | |
| Fiber Connector Crimp Tool | Thorlabs | CT042 | |
| Furcation Tubing | Thorlabs | FT030 | 03.0 mm |
| Thorlabs | T10S13 | Max Dia. 0.012 | |
| Furcation Tube Stripper | Thorlabs | FTS3 | |
| Bare Hard Cladding Multimode Fiber | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm Core, 0.37 NA |
| Wire Snips/Kevlar Shears | Thorlabs | T865 | |
| Fiber Optic Epoxy | Thorlabs | F112 | |
| Fiber Stripper Tool | Thorlabs | ||
| Glass Polishing Plate | Thorlabs | CTG913 | |
| Rubber Polishing Pad | Thorlabs | NRS913 | |
| Eye Loupe | Thorlabs | JEL10 | |
| Kim Wipes | Thorlabs | KW32 | |
| Compressed Air | Thorlabs | CA3 | |
| Polishing Puck | Thorlabs | D50-xx | |
| Fiber Inspection scope | Thorlabs | CL-200 | |
| Polishing Films | Thorlabs | LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P | |
| FC/PC connector end | Thorlabs | 30126G2-240 | 240 μm Bore, SS Ferrule |
| MC Stimulus Unit | Multi-Channel Systems | STG-4002 | |
| MC Stimulus Software | Multi-Channel Systems | MC-Stimulus V 2.1.5 | |
| Blue Laser | CrystaLaser | CL473-050-0 | |
| Laser Power supply | CrystaLaser | CL2005 | |
| Fiber Optic Rotary Joint | Doric Lenses | FRJ-v4 | |
| Table 2. Supplies and equipment. |
References
- Magistretti, P., Zigmond, M. J., Bloom, F. E., Landis, S. C., Roberts, J. L., Squire, L. R. Brain Energy Metabolism. Fundamental Neuroscience. , 389-413 (1999).
- Maquet, P., et al. Cerebral glucose utilization during sleep-wake cycle in man determined by positron emission tomography and [18F]2-fluoro-2-deoxy-D-glucose method. Brain Res. 513 (1), 136-143 (1990).
- Buchsbaum, M. S., et al. Regional cerebral glucose metabolic rate in human sleep assessed by positron emission tomography. Life Sci. 45 (15), 1349-1356 (1989).
- Kennedy, C. Local cerebral glucose utilization in non-rapid eye movement sleep. Nature. 297 (5864), 325-327 (1982).
- Pappenheimer, J. R., Koski, G., Fencl, V., Karnovsky, M. L., Krueger, J. Extraction of sleep-promoting factor S from cerebrospinal fluid and from brains of sleep-deprived animals. J. Neurophysiol. 38 (6), 1299-1311 (1975).
- Borbely, A. A., Achermann, P., Kryger, M. H., Roth, T., Dement, W. C. Sleep homeostasis and models of sleep regulation. Principles and Practice of Sleep Medicine. , 377-390 (2004).
- Destexhe, A., Contreras, D., Steriade, M. Spatiotemporal analysis of local field potentials and unit discharges in cat cerebral cortex during natural wake and sleep states. J. Neurosci. 19 (11), 4595-4608 (1999).
- Astrup, J., Sorensen, P. M., Sorensen, H. R. Oxygen and glucose consumption related to Na+-K+ transport in canine brain. Stroke. 12 (6), 726-730 (1981).
- Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
- Mateo, C. In Vivo Optogenetic Stimulation of Neocortical Excitatory Neurons Drives Brain-State-Dependent. Curr. Biol. , (2011).
- Wisor, J. P., Clegern, W. C. Quantification of short-term slow wave sleep homeostasis and its disruption by minocycline in the laboratory mouse. Neurosci. Lett. 490 (3), 165-169 (2011).
- El Yacoubi, M., et al. Behavioral, neurochemical, and electrophysiological characterization of a genetic mouse model of depression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6227-6232 (2003).
- Tsunematsu, T., et al. Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice. J. Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).
- Le, S., Gruner, J. A., Mathiasen, J. R., Marino, M. J., Schaffhauser, H. Correlation between ex vivo receptor occupancy and wake-promoting activity of selective H3 receptor antagonists. J. Pharmacol. Exp. Ther. 325 (3), 902-909 (2008).
- Burmeister, J. J., Palmer, M., Gerhardt, G. A. L-lactate measures in brain tissue with ceramic-based multisite microelectrodes. Biosens. Bioelectron. 20 (9), 1772-1779 (2005).
- Cardin, J. A. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat. Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).
- Destexhe, A., Contreras, D., Steriade, M. Cortically-induced coherence of a thalamic-generated oscillation. Neuroscience. 92 (2), 427-443 (1999).
- Liu, Z. W., Faraguna, U., Cirelli, C., Tononi, G., Gao, X. B. Direct evidence for wake-related increases and sleep-related decreases in synaptic strength in rodent cortex. J. Neurosci. 30 (25), 8671-8675 (2010).
- Iwai, Y., Honda, S., Ozeki, H., Hashimoto, M., Hirase, H. A simple head-mountable LED device for chronic stimulation of optogenetic molecules in freely moving mice. Neurosci. Res. 70 (1), 124-127 (2011).
