Genome-wide gene delezioni in<em> Streptococcus sanguinis</em> Da Throughput PCR ad alta
Summary
Un efficiente genoma unico metodo di mutazione del gene è stata stabilita utilizzando<em> Streptococcus sanguinis</em> Come organismo modello. Questo metodo ha ottenuto tramite PCR ad alto throughput ricombinanti e trasformazioni.
Abstract
Trasposone mutagenesi e singolo gene delezione sono due metodi applicati nel genoma knockout gene in 1,2 batteri. Sebbene mutagenesi trasposone è meno tempo, meno costosa, e non richiede informazioni genoma completata, vi sono due punti deboli in questo metodo: (1) la possibilità di un mutanti disparati nella libreria misto mutante che contro-seleziona mutanti con concorrenza diminuita; e (2) la possibilità di inattivazione genica parziale in cui i geni non interamente perdono la loro funzione dopo l'inserimento di un trasposone. Singolo gene delezione analisi può compensare gli svantaggi associati con mutagenesi trasposone. Per migliorare l'efficienza del genoma delezione singolo gene, si cerca di stabilire un high-throughput tecnica di genome-wide delezione del gene singolo utilizzando Streptococcus sanguinis come organismo modello. Ogni delezione del gene costruire in S. sanguinis genoma è progettata per comprendere 1-Kb a monte del gene target, l'APHA-3 gene, che codifica per proteine resistenza alla kanamicina, e 1-kb a valle del gene bersaglio. Tre serie di primer F1/R1, F2/R2 e F3/R3, rispettivamente, sono stati progettati e sintetizzati in un formato a 96 pozzetti per piastra PCR amplificazioni di questi tre componenti di ciascuna delezione costruire. Primer R1 e F3 contengono 25-bp sequenze che sono complementari alle regioni del gene-3 APHA a fine loro 5 '. Una grande scala di amplificazione PCR del gene-3 APHA viene eseguita una volta per tutte la creazione di un singolo gene costrutti di delezione. Il promotore del gene APHA-3 è inizialmente escluso per minimizzare il potenziale effetto polare di cassette kanamicina. Per creare i costrutti genici delezione, alta produttività amplificazione PCR e purificazione sono eseguite in un formato a 96 pozzetti piastra. Un lineare amplicone PCR ricombinante per ogni gene delezione sarà composta da quattro reazioni PCR utilizzando alta fedeltà DNA polimerasi. Il expon inizialefase di crescita preferenziale di S. sanguinis coltivati in brodo Todd Hewitt integrato con 2,5% siero di cavallo inattivato viene usato per aumentare la competenza per la trasformazione di PCR-costrutti ricombinanti. In questa condizione, fino al 20% di S. sanguinis cellule possono essere trasformate utilizzando ~ 50 ng di DNA. Sulla base di questo approccio, 2048 mutanti con singolo gene delezione sono stati infine ottenuti dai 2.270 geni in S. sanguinis esclusi quattro ORF del gene contenute interamente all'interno ORF altri S. sanguinis SK36 e 218 potenziali geni essenziali. La tecnica sulla creazione di costrutti di delezione del gene è un throughput elevato e potrebbe essere facile da usare in tutto il genoma gene delezioni singole per i batteri trasformabili.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per ridurre al minimo i possibili effetti polari della sostituzione di un gene esogeno gene mirata con antibiotici sui geni vicini, due passi vengono presi mentre innesco iniziale di progettazione. Per la maggior parte dei geni eliminati, il primer R1 e F3 sono progettati per eliminare la regione codificante da 6 bp dopo il codone di inizio di 30 bp prima del codone di stop. Gli ultimi 30 paia di basi sono conservati per proteggere potenziale sito di legame ribosomiale utilizzato dal gene adiacente valle. La regione tra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni R01DE018138 dal National Institutes of Health (PX) e, in parte, dal Programma Virginia Commonwealth Research presidenziale Incentive University (PRIP) 144602-3 (PX). Ringraziamo Drs. Lei Chen, Yuetan Dou e Xiaojing Wang per l'assistenza con la costruzione di mutanti genoma di larghezza. Ringraziamo anche il Core Facility DNA della Virginia Commonwealth University per il sequenziamento del DNA.
Materials
| Names | Company | Catalog# | Comments (optional) |
| Primer F2 | Integrated DNA Technologies | TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT |
|
| Primer R2 | ibid | CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT |
|
| Primer F2p | ibid | GATAAACCCAGCGAACCATTTGA | |
| Primer P1 | ibid | GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA | |
| Primer P2 | ibid | GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC | |
| Primer 5′ end_R1_seq | ibid | GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA | |
| Primer 5′ end_F3_seq | ibid | GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG | |
| Primer 5′ end_R1p_seq | ibid | CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC | |
| CSP | Synprep | Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH | |
| DNA Polymerase | Invitrogen | 11304-102 | Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity |
| EcoRI | New England Biolabs Inc | R0101S | Restriction enzyme |
| Agar | American Bioanalytical | AB01185 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| BHI | BD Biosciences | 237500 | Brain Heart Infusion |
| Horse serum | Fisher Scientific | SH3007403 | Horse serum |
| Km | Fisher Scientific | BP906-5 | Kanamycin |
| TH broth | BD Biosciences | 249240 | Todd Hewitt broth |
| PureLink 96 | Invitrogen | K310096 | PureLink 96 PCR purification kit |
| QIAquick | Qiagen | 28106 | QIAquick PCR purification kit |
| Filter | Corning | 431117 | 0.22 μm polystyrene filter |
| Anoxomat System | Mart Microbiology b.v. | Anoxomat Mark II | |
| Benchtop centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 | Sorvall Legend RT Plus microplate rotor |
| Gel Documentation | UVP LLC | BioDoc-It 210 | |
| Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | Isotemp |
| Labnet’s Gel XL | Labnet | E0160 | Labnet’s Gel XL |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 22621408 | Microcentrifuge 5415 R |
| Multichannel pipettes | Thermo Scientfic | 4661040, 4661020 | Finnpipette F1 |
| Thermal Cycler | Applied Biosystems Inc. | N805-0200 | GeneAmp PCR system 9700 |
References
- Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis. Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).
- Kobayashi, K., et al. Essential Bacillus subtilis genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).
- Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3’5″-aminoglycoside phosphotransferase type III. Gene. 23, 331-341 (1983).
- Paik, S., et al. Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis. Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).
- Lukomski, S., et al. Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization. Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, (2006).
- de Berardinis, V. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
- Rodriguez, A. M., et al. Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis. Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).
- Perry, D., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect. Immun. 32, 1295-1297 (1981).
- Pakula, R., Walczak, W. On the nature of competence of transformable streptococci. J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Xu, P., et al. Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis. Sci. Rep. 1, (2011).
