ゲノムワイドな遺伝子欠失で<em>ストレプトコッカス血統</em>ハイスループットPCRによる
Summary
効率的なゲノムワイドな単一遺伝子突然変異法は使用して確立されている<em>ストレプトコッカス血統</em>モデル生物として。この方法は、高スループット換えPCRとの変換を介して実現しています。
Abstract
トランスポゾン突然変異誘発及び単一遺伝子欠失は細菌1,2におけるゲノムワイドな遺伝子ノックアウトで適用2つの方法です。トランスポゾン突然変異誘発は、低コスト、時間の無駄であり、完成したゲノム情報を必要としませんが、この方法で2つの弱点がありますが：低下競争を有する変異体をカウンターで選択された混合された変異体ライブラリー内の異なる変異体（1）の可能性が;と、（2）部分的な遺伝子の不活性化の可能性はそれによって遺伝子が完全にトランスポゾンの挿入後に、その機能を失うことはありません。単一遺伝子欠失解析は、トランスポゾン突然変異誘発に付随する欠点を補償することができる。ゲノムワイドな単一遺伝子欠失の効率を改善するために、私たちはモデル生物として連鎖球菌血統を使ってゲノムワイドな単一遺伝子欠失のためのハイスループット技術を確立しようとします。各遺伝子の欠失は、Sで構築血統ゲノムは1を備えるように設計されています標的遺伝子の-kbの上流に、標的遺伝子のカナマイシン耐性タンパク質をコードAPHA-3遺伝子、および1-kbの下流。それぞれのプライマーF1/R1、F2/R2、F3/R3と、、の3つのセットを設計し、各欠失構築物のこれらの3つのコンポーネントのPCR増幅のための96ウェルプレートフォーマットで合成される。プライマーR1とF3はそれらの5 '末端APHA-3遺伝子の領域に相補的な25塩基対の配列を含む。 APHA-3遺伝子の大規模PCR増幅はすべて単一遺伝子欠失構築物を作成するために一回行われます。 APHA-3遺伝子のプロモーターは、当初カナマイシンカセットの潜在的な極性の影響を最小限に抑えるために除外されます。遺伝子欠失構築物を作成するには、ハイスループットPCR増幅および精製は、96ウェルプレートフォーマットで行われます。各遺伝子欠失のための線形換えPCRアンプリコンは、高忠実度DNAポリメラーゼを用いて4つのPCR反応を介して構成されます。初期EXPONSの動増殖期トッドヒューイットブロス中で培養した血統は、不活化ウマ血清をPCR-換え構築物の形質転換のために能力を高めるために使用される2.5％を補足。この条件では、Sの最大20％ 血統細胞は DNAの約50 ngを使用して変換することができます。このアプローチに基づいて、単一遺伝子欠失を持つ2048の変異体は、最終的にSの2270の遺伝子から得られたSに他のORF内に完全に含まれる4つの遺伝子のORFを除く血統血統 SK36と218潜在的な必須遺伝子。遺伝子欠失構築物を作成するための技術は、高スループットであり、任意の形質転換可能な細菌のゲノムワイドな単一遺伝子欠失で使いやすいかもしれません。
Protocol
Representative Results
Discussion
初期のプライマーが設計しながら、隣接する遺伝子の外因性の抗生物質遺伝子と1標的遺伝子の交換の可能性極性効果を最小限に抑えるためには、2つのステップがとられる。削除された遺伝子のほとんどは、プライマーR1とF3は前に終止コドンから30 bpに開始コドンに続く6 BPからコーディング領域を削除するために設計されています。最後の30塩基対は、隣接する下流遺伝子によって使用され?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、バージニアコモンウェルス大学研究所理事長奨励プログラム（PRIP）144602から3（PX）で、国立衛生研究所（PX）からの助成金によってR01DE018138と部分的にサポートされていました。我々は博士に感謝します。レイ·チェン、Yuetanドウとゲノムワイド変異体の構築をサポートするため、王をXiaojing。我々はまた、DNAシークエンシングのためにバージニアコモンウェルス大学でDNAの中核施設に感謝します。
Materials
| Names | Company | Catalog# | Comments (optional) |
| Primer F2 | Integrated DNA Technologies | TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT |
|
| Primer R2 | ibid | CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT |
|
| Primer F2p | ibid | GATAAACCCAGCGAACCATTTGA | |
| Primer P1 | ibid | GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA | |
| Primer P2 | ibid | GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC | |
| Primer 5′ end_R1_seq | ibid | GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA | |
| Primer 5′ end_F3_seq | ibid | GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG | |
| Primer 5′ end_R1p_seq | ibid | CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC | |
| CSP | Synprep | Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH | |
| DNA Polymerase | Invitrogen | 11304-102 | Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity |
| EcoRI | New England Biolabs Inc | R0101S | Restriction enzyme |
| Agar | American Bioanalytical | AB01185 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| BHI | BD Biosciences | 237500 | Brain Heart Infusion |
| Horse serum | Fisher Scientific | SH3007403 | Horse serum |
| Km | Fisher Scientific | BP906-5 | Kanamycin |
| TH broth | BD Biosciences | 249240 | Todd Hewitt broth |
| PureLink 96 | Invitrogen | K310096 | PureLink 96 PCR purification kit |
| QIAquick | Qiagen | 28106 | QIAquick PCR purification kit |
| Filter | Corning | 431117 | 0.22 μm polystyrene filter |
| Anoxomat System | Mart Microbiology b.v. | Anoxomat Mark II | |
| Benchtop centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 | Sorvall Legend RT Plus microplate rotor |
| Gel Documentation | UVP LLC | BioDoc-It 210 | |
| Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | Isotemp |
| Labnet’s Gel XL | Labnet | E0160 | Labnet’s Gel XL |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 22621408 | Microcentrifuge 5415 R |
| Multichannel pipettes | Thermo Scientfic | 4661040, 4661020 | Finnpipette F1 |
| Thermal Cycler | Applied Biosystems Inc. | N805-0200 | GeneAmp PCR system 9700 |
References
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