בידוד תאים כמו Melanocyte-ראשיים מלב העכבר
Summary
בפרוטוקול זה, w הדואר זיהה אוכלוסיית רומן של תאים כמו melanocyte-(הידוע גם במלנוציטים לב) בלבם של עכברים ובני אדם שתורם להפרעות קצב פרוזדורים גורמת בעכברים.
Abstract
זיהינו אוכלוסיית רומן של תאים כמו melanocyte-(הידוע גם במלנוציטים לב) בלבם של עכברים ובני אדם שתורמים לגורמי הפרעת קצב פרוזדורים בעכברים. כדי לחקור את התכונות חשמליות וביולוגיות של מלנוציטים לב פיתחנו הליך לבודד אותם מלב העכבר שנגזרים מאלה שנועדו לבודד את שריר לב עכברי בילוד. על מנת לקבל מלנוציטים לב בריאים מתאימים למהדק תיקון נרחב יותר או מחקרים ביוכימיים, שפיתחנו הליך מעודן לבידוד וציפוי מלנוציטים לב המבוססים על אלה שתוכננו במקור לבודד מלנוציטים עורית. ההליך המעודן בא לידי הביטוי בסקירה זו ומייצר מספרים גדולים יותר של תאים כמו melanocyte הבריאים שיכול להיות מצופה כאוכלוסייה טהורה או עם שריר לב.
Introduction
לאחרונה זיהו אוכלוסיית תא רומן בלב של עכברים ובני האדם שמבטאים את אנזימי מלנין-סינתזה ומורפולוגית דומה מלנוציטים עורית. אנו נקראים 'מלנוציטים הלב' התאים אלה ומצאנו שהם נמצאים במקומות אנטומיים שממנו הפרעת קצב פרוזדורים מתעורר בי לעתים קרובות מקורן בבני אדם. מצאנו גם מלנוציטים לב לתרום להפרעות קצב פרוזדורים בעכברים עם מחיקה בתאי מין של DCT. מלנוציטים לב מופצים בדלילות לאורך אטריום העכבר שבו הם מהווים פחות מ -0.1% מכל תאי פרוזדורים. כדי לחקור את התכונות חשמליות וביולוגיות של מלנוציטים לב פיתחנו הליך לבודד אותם מלב העכבר באמצעות סמנים ספציפיים melanocyte Cre-מושרה. ההליך הראשוני שלנו פותח מאלו המשמשים לבודד את שריר לב עכברי בילוד ומספרים קטנים מאוד הניבו של תאים מתאימים להקלטות מהדק תיקון או ניתוח PCR. עם זאת, על מנת לשפר את לרפאה ואת הכדאיות של מלנוציטים לב, ליותר בניתוח המעמיק אלקטרו או מחקרים ביוכימיים, שפיתחנו הליך מעודן מאלה שנועדו לבודד את מלנוציטים עורית. יש ההליך המתואר והפגין בסקירה זו את היתרון של ייצור מלנוציטים לב בריאים שיכול להיות מצופה כאוכלוסייה טהורה או עם שריר לב.
Protocol
Representative Results
Discussion
מלנוציטים לב נמצאים במקומות אנטומיים בתוך הלב, כי בדרך כלל לגרום לטריגרים הפרעות קצב פרוזדורים. אזורים אלה כוללים את ורידי ריאה, annulus בין העליות והחדרים, המבואה האחורית עזב וovale הנקב (איור 4). כדי להבין את תפקיד תאים אלה לשחק בarrhythmogenesis, אנו מפתחים טכניקות לבודד…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בפרס R01 HL105734 לVVPMDL נתמך, בין שאר, על ידי המכון הלאומי לבריאות בקריירה מחקר פרס K08 HL094748. VVP הוא חוקר חדשני של איגוד הלב האמריקאי נתמך על ידי מענק 11IRG900384.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comment |
| MCDB 153 | Sigma-Aldrich | M7403 | Dissolve in: Water |
| DPBS, no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190136 | Stock Conc.: 1X Working Conc.: 1X |
| Sodium Bicarbonate, or Sodium Bicarbonate Solution, 7.5% | Sigma-Aldrich | S5761 or S8761 | Water Stock Conc.: 1X Working Conc.: 1X |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140163 | Stock Conc.: 100X Working Conc.: 1X |
| Fetal Bovine Serum | Life Technology | Certified | Working Conc.: 4% |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | DMSO Stock Conc.: 3.2 μM Working Conc.: 32 nM |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | DPBS Stock Conc.: 0.1 mg/ml Working Conc.: 1 μg/ml |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | DPBS Stock Conc.: 0.5 mM Working Conc.: 5 μM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 10 mM
acetic acid Stock Conc.: 1 mg/ml Working Conc.: 5 μg/ml |
| Basic FGF | BD Biosciences | 354060 | Water Stock Conc.: 4 ng/μl Working Conc.: 4 ng/ml |
References
- Hornyak, T. J., et al. Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).
- Yonetani, S., et al. In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle. J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).
- Levin, M. D., et al. Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers. J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).
- Patel, V. V. Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation. Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).
- Sviderskaya, E. V., et al. Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells. FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).
- Sviderskaya, E. V., et al. P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation. J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).
- Cook, A. L., et al. Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3. J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Brito, F. C., et al. Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).
- Yajima, I., et al. The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).
