Isolamento di cellule melanociti-come primario dal Cuore del mouse
Summary
In questo protocollo, w e identificato una popolazione romanzo di cellule melanociti-simile (anche conosciuto come melanociti cardiaci) nel cuore dei topi e gli esseri umani che contribuiscono ad aritmia atriale provoca nei topi.
Abstract
Abbiamo identificato una popolazione romanzo di cellule melanociti-simile (anche conosciuto come melanociti cardiaci) nel cuore dei topi e gli esseri umani che contribuiscono a trigger di aritmia atriale nei topi. Per studiare le proprietà elettriche e biologiche dei melanociti cardiaci abbiamo sviluppato una procedura per isolarli dai cuori di topo che derivati da quelli progettati per isolare cardiomiociti murini neonatali. Al fine di ottenere melanociti cardiache sane adatte per una più ampia patch clamp o studi biochimici, abbiamo sviluppato una procedura raffinata per isolare e placcatura melanociti cardiaci basati su quelli originariamente progettato per isolare melanociti cutanei. La procedura raffinata è dimostrato in questa recensione e produce un numero maggiore di cellule melanociti-come sani che può essere placcato come una popolazione pura o con cardiomiociti.
Introduction
Abbiamo recentemente identificato una popolazione di cellule romanzo nel cuore di topi e gli esseri umani che esprimono enzimi melanina-sintesi e morfologicamente assomigliano melanociti cutanei. Abbiamo chiamato 'melanociti cardiaci' queste cellule e l'ho trovato sono presenti in posizioni anatomiche da cui aritmia atriale trigger spesso origine negli esseri umani. Abbiamo anche trovato melanociti cardiaci contribuiscono ad aritmie atriali nei topi con delezione linea germinale di Dct. Melanociti cardiache sono scarsamente distribuiti in tutto l'atrio del mouse dove essi costituiscono meno dello 0,1% di tutte le cellule atriali. Per studiare le proprietà elettriche e biologiche dei melanociti cardiaci abbiamo sviluppato una procedura per isolarli dal cuore mouse utilizzando marcatori specifici melanociti Cre-inducibile. La nostra procedura iniziale è stato sviluppato da quelli utilizzati per isolare cardiomiociti murini neonatali e fruttate molto piccolo numero di cellule adatti per le registrazioni di patch clamp o analisi PCR. Tuttavia, per migliorare la guarigioneesima e la vitalità dei melanociti cardiaci, per più approfondita analisi elettrofisiologica o studi biochimici, abbiamo sviluppato una procedura raffinata da quelli progettati per isolare melanociti cutanei. La procedura descritta e dimostrata in questa recensione ha il vantaggio di produrre sani melanociti cardiaco che può essere placcato come una popolazione pura o con cardiomiociti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Melanociti cardiache sono presenti in sedi anatomiche all'interno del cuore che spesso danno luogo a trigger aritmie atriali. Queste regioni comprendono le vene polmonari, l'anello atrioventricolare, posteriore sinistra dell'atrio e del forame ovale (Figura 4). Per comprendere il ruolo di queste cellule svolgono in aritmogenesi, sviluppiamo tecniche per isolare loro e studiare la loro fisiologia. Tuttavia, abbiamo riconosciuto che il miglioramento di questa tecnica a cedere quantitativi più…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of award Salute R01 HL105734 a VVPMDL è supportato, in parte, dal National Institutes of Health Research Career Award K08 HL094748. VVP è un ricercatore innovativo della American Heart Association sostenuta da sovvenzioni 11IRG900384.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comment |
| MCDB 153 | Sigma-Aldrich | M7403 | Dissolve in: Water |
| DPBS, no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190136 | Stock Conc.: 1X Working Conc.: 1X |
| Sodium Bicarbonate, or Sodium Bicarbonate Solution, 7.5% | Sigma-Aldrich | S5761 or S8761 | Water Stock Conc.: 1X Working Conc.: 1X |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140163 | Stock Conc.: 100X Working Conc.: 1X |
| Fetal Bovine Serum | Life Technology | Certified | Working Conc.: 4% |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | DMSO Stock Conc.: 3.2 μM Working Conc.: 32 nM |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | DPBS Stock Conc.: 0.1 mg/ml Working Conc.: 1 μg/ml |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | DPBS Stock Conc.: 0.5 mM Working Conc.: 5 μM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 10 mM
acetic acid Stock Conc.: 1 mg/ml Working Conc.: 5 μg/ml |
| Basic FGF | BD Biosciences | 354060 | Water Stock Conc.: 4 ng/μl Working Conc.: 4 ng/ml |
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