Isolar células de melanócito-like primárias do coração mouse
Summary
Neste protocolo, w e identificou um novo população de células de melanócito-like (também conhecido como melanócitos cardíacos) nos corações de ratos e humanos que contribuem para a arritmia atrial dispara em camundongos.
Abstract
Foi descoberta uma nova população de células de melanócitos tipo (também conhecido como melanócitos cardíaca) nos corações de ratos e seres humanos, que contribuem para os gatilhos de arritmias atriais em ratinhos. Para investigar as propriedades elétricas e biológicos de melanócitos cardíacos foi desenvolvido um procedimento para isolá-los do rato corações que nós derivados das destinadas a isolar cardiomiócitos murinos neonatais. A fim de obter melanócitos cardíacos saudáveis adequados para mais extensa patch clamp ou estudos bioquímicos, foi desenvolvido um procedimento refinado para isolar e cultivar melanócitos cardíacos baseados naqueles originalmente projetado para isolar os melanócitos cutâneos. O procedimento refinado é demonstrado nesta revisão e produz um maior número de células de melanócito-like saudáveis que pode ser banhado em uma população pura ou com cardiomiócitos.
Introduction
Nós recentemente identificada uma população de células romance no coração de camundongos e humanos que expressam enzimas melanina-síntese e morfologicamente se assemelham melanócitos cutâneos. Chamamos 'melanócitos cardíacos' essas células e descobrimos que eles estão presentes em locais anatômicos a partir do qual arritmia atrial desencadeia muitas vezes se originam em seres humanos. Encontramos também melanócitos cardíacos contribuir para arritmias atriais em camundongos com deleção da linhagem germinativa de Dct. Melanócitos cardíacas são escassamente distribuídos por todo o átrio do rato onde eles compreendem menos de 0,1% de todas as células atriais. Para investigar as propriedades elétricas e biológicos de melanócitos cardíacos foi desenvolvido um procedimento para isolá-los do coração mouse usando marcadores específicos de melanócitos Cre-induzida. Nosso procedimento inicial foi desenvolvido daqueles usados para isolar cardiomiócitos murinos neonatais e rendeu um pequeno número de células adequadas para gravações de patch clamp ou análise de PCR. No entanto, para melhorar a curarº e viabilidade de melanócitos cardíacas, para mais aprofundada análise eletrofisiológica ou estudos bioquímicos, foi desenvolvido um procedimento refinado e as destinadas a isolar melanócitos cutâneos. O processo descrito e demonstrado neste teste tem a vantagem de produzir melanócitos cardíacas saudáveis, que podem ser plaqueadas como uma população pura ou com cardiomiócitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Melanócitos cardíacas estão presentes em locais anatômicos dentro do coração que normalmente dão origem a gatilhos arritmia atrial. Essas regiões incluem as veias pulmonares, o anel atrioventricular, a posterior do átrio esquerdo e do forame oval (Figura 4). Para compreender o papel dessas células desempenham na arritmogênese, desenvolvemos técnicas para isolá-los e estudar sua fisiologia. No entanto, reconhecemos que melhorar esta técnica para produzir quantidades mais saudáveis e …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of prêmio Saúde R01 HL105734 para VVPMDL é suportado, em parte, pelo National Institutes of Health Research Career Award K08 HL094748. VVP é um pesquisador inovador da American Heart Association apoiada pela concessão 11IRG900384.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comment |
| MCDB 153 | Sigma-Aldrich | M7403 | Dissolve in: Water |
| DPBS, no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190136 | Stock Conc.: 1X Working Conc.: 1X |
| Sodium Bicarbonate, or Sodium Bicarbonate Solution, 7.5% | Sigma-Aldrich | S5761 or S8761 | Water Stock Conc.: 1X Working Conc.: 1X |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140163 | Stock Conc.: 100X Working Conc.: 1X |
| Fetal Bovine Serum | Life Technology | Certified | Working Conc.: 4% |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | DMSO Stock Conc.: 3.2 μM Working Conc.: 32 nM |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | DPBS Stock Conc.: 0.1 mg/ml Working Conc.: 1 μg/ml |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | DPBS Stock Conc.: 0.5 mM Working Conc.: 5 μM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 10 mM
acetic acid Stock Conc.: 1 mg/ml Working Conc.: 5 μg/ml |
| Basic FGF | BD Biosciences | 354060 | Water Stock Conc.: 4 ng/μl Working Conc.: 4 ng/ml |
References
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