Isolera Primära melanocyt liknande celler från mus Heart
Summary
I detta protokoll w e identifierat en ny population av melanocytstimulerande liknande celler (även känd som hjärt melanocyter) i hjärtat hos möss och människor som bidrar till förmaksarytmi utlöser hos möss.
Abstract
Vi identifierade en ny population av melanocytstimulerande liknande celler (även känd som hjärt melanocyter) i hjärtat hos möss och människor som bidrar till förmaksarytmi triggers i möss. För att undersöka de elektriska och biologiska egenskaper hjärt melanocyter vi utvecklat ett förfarande för att isolera dem från mus hjärtan som vi kommer från sådana som är konstruerade för att isolera neonatal murina cardiomyocytes. För att få hälsosammare hjärt melanocyter lämpliga för mer omfattande patch klämma eller biokemiska studier, utvecklade vi en raffinerad förfarande för isolering och plätering hjärt melanocyter baserade på dem ursprungligen för att isolera kutan melanocyter. Den raffinerade förfarande demonstreras i denna översyn och ger större antal friska melanocytstimulerande liknande celler som kan pläterade som en ren population eller med hjärtmuskelceller.
Introduction
Vi identifierade nyligen en ny cellpopulation i hjärtat av möss och människor som uttrycker melanin-syntesenzymer och morfologiskt liknar kutan melanocyter. Vi kallade dessa cellers hjärt melanocyter "och hittade de ingår i anatomiska platser från vilka förmaksarytmi utlöser ofta sitt ursprung i människor. Vi fann också hjärt melanocyter bidrar till förmaksarytmier i möss med könsceller radering av Dct. Hjärt melanocyter är glest fördelade i musen atrium där de utgör mindre än 0,1% av alla förmaksceller. För att undersöka de elektriska och biologiska egenskaper hjärt melanocyter vi utvecklat ett förfarande för att isolera dem från musen hjärtat med hjälp av Cre-inducerbart melanocytstimulerande specifika markörer. Vår inledande förfarandet utvecklades från dem som används för att isolera neonatal murina cardiomyocytes och gav ett mycket litet antal celler lämpliga för patch clamp inspelningar eller PCR-analys. Emellertid, för att förbättra läkae och livskraft hjärt melanocyter, för mer djupgående elektrofysiologiska analyser eller biokemiska studier, utvecklade vi en raffinerad proceduren från sådana som är konstruerade för att isolera kutan melanocyter. Det förfarande som beskrivs och demonstreras i denna genomgång har fördelen att producera friskare hjärt melanocyter som kan pläterade som en ren population eller med kardiomyocyter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hjärtat melanocyter finns i anatomiska platser i hjärtat som vanligtvis ger upphov till förmaksarytmi triggers. Dessa områden innefattar lungvenerna, det atrioventrikulärt ringen, den bakre vänster förmak och foramen ovale (Figur 4). För att förstå vilken roll dessa celler spelar i arrhythmogenesis utvecklar vi metoder för att isolera dem och studera deras fysiologi. Dock erkände vi att förbättra denna teknik för att ge friskare och större mängder av hjärt melanocyter skulle tillåta y…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health utmärkelse R01 HL105734 till VVPMDL stöds delvis av National Institutes of Health Research Career Award K08 HL094748. VVP är ett innovativt forskare på American Heart Association med stöd av bidrag 11IRG900384.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comment |
| MCDB 153 | Sigma-Aldrich | M7403 | Dissolve in: Water |
| DPBS, no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190136 | Stock Conc.: 1X Working Conc.: 1X |
| Sodium Bicarbonate, or Sodium Bicarbonate Solution, 7.5% | Sigma-Aldrich | S5761 or S8761 | Water Stock Conc.: 1X Working Conc.: 1X |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140163 | Stock Conc.: 100X Working Conc.: 1X |
| Fetal Bovine Serum | Life Technology | Certified | Working Conc.: 4% |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | DMSO Stock Conc.: 3.2 μM Working Conc.: 32 nM |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | DPBS Stock Conc.: 0.1 mg/ml Working Conc.: 1 μg/ml |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | DPBS Stock Conc.: 0.5 mM Working Conc.: 5 μM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 10 mM
acetic acid Stock Conc.: 1 mg/ml Working Conc.: 5 μg/ml |
| Basic FGF | BD Biosciences | 354060 | Water Stock Conc.: 4 ng/μl Working Conc.: 4 ng/ml |
References
- Hornyak, T. J., et al. Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).
- Yonetani, S., et al. In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle. J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).
- Levin, M. D., et al. Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers. J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).
- Patel, V. V. Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation. Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).
- Sviderskaya, E. V., et al. Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells. FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).
- Sviderskaya, E. V., et al. P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation. J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).
- Cook, A. L., et al. Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3. J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Brito, F. C., et al. Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).
- Yajima, I., et al. The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).
