Isoler des cellules mélanocytes comme primaires du Cœur de souris

Summary

Dans ce protocole, w e identifié une nouvelle population de cellules mélanocytes comme (également connu sous le nom mélanocytes cardiaques) dans le cœur des souris et des humains qui contribuent à une arythmie auriculaire déclenche chez la souris.

Abstract

Nous avons identifié une nouvelle population de cellules mélanocytes comme (également connu sous le nom mélanocytes cardiaques) dans le cœur des souris et des humains qui contribuent aux déclencheurs de l'arythmie auriculaire chez la souris. Pour étudier les propriétés électriques et biologiques des mélanocytes cardiaques, nous avons développé une procédure pour les isoler de coeurs de souris que nous avons tirés de celles qui visent à isoler les cardiomyocytes murins néonataux. Afin d'obtenir des mélanocytes cardiaques saines appropriés pour plus vaste patch clamp ou des études biochimiques, nous avons développé une procédure raffinée pour isoler et placage mélanocytes cardiaques basés sur ceux à l'origine conçu pour isoler les mélanocytes cutanés. La procédure est mise en évidence raffiné dans cette revue et produit un plus grand nombre de cellules saines comme des mélanocytes, qui peuvent être étalées en une population pure ou avec des cardiomyocytes.

Introduction

Nous avons récemment identifié une nouvelle population de cellules dans le cœur de souris et les humains qui expriment des enzymes mélanine synthèse et ressemblent morphologiquement mélanocytes cutanés. Nous avons appelé de mélanocytes cardiaques »ces cellules et avons découvert qu'ils sont présents dans des endroits anatomiques dont arythmie auriculaire déclenche proviennent souvent chez l'homme. Nous avons également constaté mélanocytes cardiaques contribuent à des arythmies auriculaires chez la souris avec la suppression de la lignée germinale DCT. Mélanocytes cardiaques sont peu distribués dans l'atrium de la souris où elles contiennent moins de 0,1% de toutes les cellules auriculaires. Pour étudier les propriétés électriques et biologiques des mélanocytes cardiaques, nous avons développé une procédure pour les isoler du cœur de la souris en utilisant des marqueurs spécifiques mélanocytes Cre inductible. Notre procédure initiale a été développé à partir de ceux utilisés pour isoler les cardiomyocytes murins néonataux et donné de très petits nombres de cellules appropriées pour les enregistrements de patch-clamp ou analyse par PCR. Cependant, pour améliorer la guérisone et la viabilité des mélanocytes cardiaques, pour plus d'une analyse en profondeur électrophysiologique ou des études biochimiques, nous avons développé une procédure raffinée de celles qui visent à isoler les mélanocytes cutanés. Le procédé décrit et démontré dans la présente étude a pour avantage de produire des mélanocytes sains cardiaques qui peuvent être étalées en une population pure ou avec des cardiomyocytes.

Protocol

1 Préparation des solutions et des équipements nécessaires Tout d'abord, stériliser les instruments chirurgicaux (pinces droites de forme, pinces de forme incurvée, ciseaux de forme droite et ciseaux de forme incurvée) par les autoclavage pendant 15 min. à 121 ° C. Préparez 2 ensembles d'instruments, où un jeu est utilisé pour disséquer les cœurs et l'autre ensemble sera utilisé pour hacher le tissu. Dissoudre 1 sachet de MCDB153 milieux de culture dans 900 ml d'stéril…

Representative Results

Le protocole décrit dans cet article est une technique améliorée par rapport à celle que nous avons déjà publié pour isoler les mélanocytes cardiaques du cœur murin. Ce procédé emploie l'utilisation de marqueurs fluorescents entraînés par la synthèse de mélanine spécifique de l'enzyme Cre-recombinase pour marquer les cellules de mélanocytes analogue cardiaques. Il est important d'utiliser un marqueur pour marquer les mélanocytes cardiaques lorsque vous travaillez avec des cellules embryonna…

Discussion

Mélanocytes cardiaques sont présents dans des endroits anatomiques dans le cœur qui donnent souvent lieu à des déclencheurs d'arythmie auriculaire. Ces régions comprennent les veines pulmonaires, l'anneau auriculo-ventriculaire, l'oreillette gauche postérieure et le foramen ovale (figure 4). Pour comprendre le rôle de ces cellules jouent dans arythmogénèse, nous développons des techniques de les isoler et d'étudier leur physiologie. Cependant, nous avons constaté que l'a…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comment
MCDB 153	Sigma-Aldrich	M7403	Dissolve in: Water
DPBS, no calcium no magnesium	Invitrogen	14190136	Stock Conc.: 1X Working Conc.: 1X
Sodium Bicarbonate, or Sodium Bicarbonate Solution, 7.5%	Sigma-Aldrich	S5761 or S8761	Water Stock Conc.: 1X Working Conc.: 1X
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140163	Stock Conc.: 100X Working Conc.: 1X
Fetal Bovine Serum	Life Technology	Certified	Working Conc.: 4%
TPA	Sigma-Aldrich	P1585	DMSO Stock Conc.: 3.2 μM Working Conc.: 32 nM
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158	DPBS Stock Conc.: 0.1 mg/ml Working Conc.: 1 μg/ml
Dibutyryl cyclic AMP	Sigma-Aldrich	D0627	DPBS Stock Conc.: 0.5 mM Working Conc.: 5 μM
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	10 mM acetic acid Stock Conc.: 1 mg/ml Working Conc.: 5 μg/ml
Basic FGF	BD Biosciences	354060	Water Stock Conc.: 4 ng/μl Working Conc.: 4 ng/ml