Summary
We stellen een nieuwe werkwijze voor het onderhoud van menselijke intestinale mucosa in cultuur en controle van de reactie op verschillende soorten stimuli gedurende tenminste 24 uur. Bij onze werkwijze, wordt de polariteit van het weefsel gehandhaafd, waardoor een fysiologische stimulering via de apicale route.
Abstract
Enkele modellen die nu bestaan om realistisch te simuleren van de complexe menselijke darm micro-omgeving, waar een verscheidenheid aan interacties plaatsvinden. Juiste homeostase direct afhankelijk van deze interacties als ze vormen een volledige immunologische respons induceren van tolerantie tegen voedsel antigenen, terwijl tegelijkertijd montage effectieve immuunrespons tegen pathogene microben ongeluk wordt ingenomen met voedsel.
Intestinale homeostase is ook bewaard gebleven door middel van verschillende complexe interacties tussen de microbiota (inclusief voedsel-geassocieerde gunstige bacteriestammen) en de gastheer, die de bevestiging / degradatie van slijm te regelen, de productie van antimicrobiële peptiden door de epitheliale barrière, en de "opvoeding" van epitheelcellen bevolking 'dat de tolerogene of immunogene fenotype van unieke, darm-resident lymfecellen bestuurt'. Deze interacties zijn tot dusver zeer moeilijk te reproduceren met in vitro assaysbehulp van gekweekte cellijnen of perifere mononucleaire bloedcellen. Bovendien muismodellen aanzienlijk verschillen in bestanddelen van het darmslijmvlies (slijmlaag organisatie commensaalbacteriën gemeenschap) ten opzichte van de menselijke darm. Aldus hebben studies van verschillende behandelingen te brengen in de klinieken voor belangrijke stress of pathologische aandoeningen zoals prikkelbare darmsyndroom, inflammatoire darmziekte of colorectale kanker moeilijk uitvoerbaar zijn.
Om deze problemen aan te pakken, hebben we een nieuw systeem dat ons in staat stelt om explantaten van het menselijk darmslijmvlies dat hun in situ conditionering behouden door de gastheer microbiota en de immuunrespons te stimuleren, in een gepolariseerde fashion ontwikkeld. Gepolariseerde apicale stimulatie is van groot belang voor het resultaat van de opgewekte immuunreactie. Het is herhaaldelijk aangetoond dat dezelfde stimuli produceren totaal verschillende reacties wanneer en passeren apicale oppervlak van de intestinale epithelium, het stimuleren van epitheelcellen basolateraal of die in direct contact met de lamina propria onderdelen, schakelen het fenotype van tolerogene tot immunogeen en het veroorzaken van onnodige en overmatige ontsteking in het gebied.
We bereikten gepolariseerd stimulatie door lijmen een grot cilinder die afgebakend het gebied van stimulatie op de apicale gezicht van het slijmvlies zoals zal in het protocol worden beschreven. We gebruikten dit model te onderzoeken, onder meer differentiële effecten van drie verschillende Lactobacilli stammen. We tonen aan dat dit model systeem is zeer krachtig om de immunomodulerende eigenschappen van probiotica te beoordelen bij gezonde en aandoeningen.
Protocol
1. Het verkrijgen en voorbereiden van de Tissue
- Weefsel (mucosa gezond of IBD) wordt verkregen tijdens de operatie. Nadat het monster uitgesneden overdracht naar het lab zo snel mogelijk hem in Ca + + / Mg + +-vrij HBSS buffer gesupplementeerd met Pen / Strep bij 4 ° C of op ijs.
* De grootte van het monster is afhankelijk van de beschikbaarheid van het weefsel: het gedeelte van het verkregen weefsel, strikt wat niet nodig is voor diagnose en kan sterk variëren tussen gezonde proefpersonen en IBD. Gezond weefsel wordt uitgesneden uit patiënten die een operatie voor darmkanker.
- Spoel het weefsel voorzichtig en maak het schoon van alle mesenteriale materiaal. Scheid de mucosa laag van de submucosa met steriele scharen en pincetten terwijl het weefsel in HBSS buffer in een petrischaal (niet noodzakelijkerwijs gedompeld). Raak het mucosale oppervlak van de tang zo weinig mogelijk.
- Snijd slijmvlies in strepen ten minste 1 cm breed en zo lang mogelijk. Gebruik twee steriele scalpels, veel alsof u uw voedsel snijden.
- Wassen schoon slijmvlies zachtjes in HBSS en uit te breiden op een petrischaal met de apicale zijde naar boven.
2. Montage van het Weefsel
- Bereid vers medium (tisDMEM). Gebruik DMEM aangevuld met glutamine (2 mM) en NaPyr (1 mM) en voeg 15% FBS-Na (Fetal Bovine Serum - North American), 1% ITS-X en 200 ng / ml EGF op het moment van gebruik.
- Vul een 10 cm petrischaal met de rest van de FBS-Na (gebruik ongeveer 30 ml, zodat metalen roosters volledig zal worden ondergedompeld) en dompel de metalen roosters. Houd de plaat de plastic flessen te openen en te ondersteunen op zijn tap.
* De metalen roosters zijn gemaakt van ijzer. De mazen vierkant met een zijde van 0,5 mm.
- Neem 3 pl chirurgische lijm met een 10 of 20 ul pipet. Breng het voorzichtig aan een van de grenzen van een kunststof cilinder terwijl het fIRM met de tang.
- Plaats voorzichtig de cilinder aan de apicale zijde van de mucosa, zoals dicht bij een van de randen van de strip mogelijk.
- Om de lijm tijd te geven om stevig hechten de cilinder op het weefsel, de voorbereiding van de centrum-goed orgelcultuur plaat: Verdeel 850 pi-1 ml medium in het centrum goed en ondersteunen het metalen rooster aan de randen van het centrale putje van de plaat.
- Weggesneden overtollige weefsel van de grenzen van de cilinder met twee steriele scalpels als voorheen.
- Til de cilinder met de aangehechte weefsel en plaatst de basolaterale zijde van de metalen rooster in het midden van de plaat.
3. Prikkel
- Gebruik de stimuli van uw keuze in de gewenste concentratie.
- Pas geschikte volume in het midden van de plastic cilinder zonder de cilinder of het mucosale oppervlak met de pipetpunt verstoren. Zorg ervoor dat uw gekozen bundel wordt gelijkmatig het oppervlak in de cilinder. Indicated volumes:
Grote kunststof cilinder: 200 pi
Medium kunststof cilinder: 100 pl
Kleine plastic cilinder: 50 ui - Incubeer 3 uur in een conventionele incubator.
* Als u wilt incubeer gedurende langere tijd punten, zorg ervoor dat je een veel kleiner volume van stimuli (10-20 pi) te gebruiken en direct plaats het weefsel in een atmosfeer van 100% O 2 in de druk van 1 atm (zie 3.5) .
- Neem het medium met de stimuli van de apicale oppervlak van het weefsel en NIET VERVANGEN met vers medium, omdat het weefsel niet genoeg krijgen O 2 als een dikke laag medium op de apicale gezicht voorkomt gasuitwisseling. Bedek het bord.
- Plaats het weefsel in een atmosfeer van 100% O2 in de druk van 1 atm.
4. Oogst
- Na 24 uur van de totale cultuur tijd (± 2,5 uur) verwijder voorzichtig de cilinder van the weefsel met behulp van een scalpel voorzichtig schrapen lijm uit en slaan afhankelijk van de gewenste analyse (vast voor immunohistochemie en / of immunofluorescentie assays of snap bevriezen in vloeibare N2 voor RNA-zuivering en genexpressie of eiwit zuivering en Western blot assays ).
- Oogst de basolaterale medium voor cytokinesecretie profilering. Centrifugeer bij 8.000 rpm gedurende 7 minuten tot pellet puin, breng de bovenstaande vloeistof in een Eppendorf buis (alternatief aliquot) en direct bewaard bij -20 ° C.
* Als u wilt supernatanten langer te bewaren, bewaar ze bij -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We erin geslaagd in het behoud van gezonde en IBD menselijk darmslijmvlies in de cultuur gedurende minstens 24 uur behouden het welzijn van het weefsel. In overeenstemming met eerdere waarnemingen 1 was dit alleen mogelijk als de meerderheid van de kweekperiode (ten minste 85% van het totaal) vond plaats in O 2, zoals het weefsel niet overleven 24 uur in gebruikelijke incubatoren (figuur 2). We hebben ook aangetoond dat verschillende reacties van de explantaten kan worden waargenomen op dit model afhankelijk van de polariteit van de stimulatie (apicale vs basolaterale) en de immunogeniciteit van de stimuli 2,3.
Met dit protocol, tonen we dat verschillende probiotische stammen verschillende reacties kunnen uitlokken op een deel van het weefsel. Lactobacillus plantarum NCIMB8826 bleek verrassend immunogeen op gezond weefsel. In tegenstelling tot de twee andere stammen Lactobacilli, niet alleen het migratie van lymfoïde cellen induceren wards het bovenste oppervlak van de mucosa, maar ook aanzienlijk opgereguleerd een chemokine deze migratie CCl4, evenals IL-1b, een cytokine traditioneel betrekking tot pro-inflammatoire activiteit relevant. Tot onze verrassing, hoewel we hadden eerder een preventieve werking van L. waargenomen paracasei in een muismodel van colitis 4, dit niet te vertalen naar een curatieve werking bij levende bacteriën van deze stam werden aangebracht op ontstoken IBD weefsel. Integendeel, de drie stammen bleek nadelig bij gebruik op IBD mucosa in de acute fase van de ziekte 2.
Verder hebben we aangetoond dat het metabolische product van een probioticum, genaamd postbiotic, kan afscherming gezonde epitheel tegen een vrij invasieve Salmonella-stam (FB62), terwijl tegelijkertijd aanzienlijk verbetert ontsteking wanneer toegepast op IBD mucosa 2.
_upload/4368/4368fig1.jpg "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4368/4368fig1hires.jpg "/>
Figuur 1. Schematische weergave van de opstelling en bekijken. Een. Schematische weergave van de opzet van de zijkant gezien, b. Schematische weergave van de opzet van bovenaf gezien, c. Foto van metalen rooster als ondersteuning de explantatie. Bij correcte plaatsing, alleen de basolaterale zijde in contact komt met het centrale medium kamer, d. Foto van het hele ensemble. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Het weefsel overleeft enige cultuur in O 2. A. Onbeschaafde weefsel, vast bij aankomst van de operatiekamer,
Figuur 3 Het effect van een pro-inflammatoire stimuli explantaten C-:-gestimuleerde weefsel gekweekt gedurende de aangegeven tijdstippen, Sal:.. Tissue uitgedaagd met Salmonella en gedurende de aangegeven tijdstippen. De vernietiging van de bovenste laag van het epitheel is al zichtbaar na 2 uur. De explant presenteert uitgebreide degeneratie na 24 uur. Originele vergroting: 10X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De behoefte aan fysiologisch relevante modellen waarop behandelingen voor menselijke darmslijmvlies geldig kan worden getest is lang benadrukt. Veel onderzoekers hebben potentiële artefacten en geïdentificeerd in zowel cel 5 en muismodellen 6 tot dusver voor dat doel gebruikt. Sterker nog, ook al veelbelovende preklinische gegevens wordt vaak verkregen, deze zelden te vertalen naar significant klinisch voordeel.
De methode in dit werk beschreven, geeft een relatief eenvoudige, maar effectieve en nieuwe aanpassing aan bestaande protocollen 7, 8 voor de cultuur en stimulatie van humane intestinale mucosa explantaten in een gepolariseerde fashion.
Dit model zou een uitstekende complementaire aanpak voor het genereren van geldige pre-klinische gegevens te verstrekken alvorens een potentiële behandeling van welke aard dan ook aan de klinieken. Zo zou jammer klinische resultaten 9 mogelijk worden vermeden en onderzoekers konden meerveilig te bevorderen behandelingen om de klinieken voor de behandeling van acute ontstekingen.
De belangrijkste voordelen van het model zijn de mogelijkheid om te vergelijken gepolariseerde versus niet gepolariseerd stimulatie en om de reactie van het weefsel te volgen over een 24-uurs tijdsbestek. Een belangrijke parameter is dat in ieder experiment, de verschillende behandelingen explantaten afkomstig van dezelfde patiënt waarbij rekening kan worden gehouden met variabiliteit tussen patiënten worden toegepast. Dat de explantaten zijn van een relatief grote omvang in vergelijking met biopsieën betekent ook dat een aantal analyses kan worden uitgevoerd op dezelfde explantatie bevestiging resultaten op diverse verschillende manieren (ELISA assays, kwantitatieve rtPCRs, microarray analyses, immunohistochemie en / of immunofluorescentie data). Verder kunnen andere soorten analyses worden geoptimaliseerd in de toekomst, zoals zuivering van celpopulaties plaats van gestimuleerde explantaten en evaluatie van hun fenotype cytofluorimetric analysis.
Er zijn echter ook belangrijke beperkingen rekening worden gehouden. Op zijn huidige vorm is dit model niet geschikt voor high throughput screening van een groot aantal behandelingen, zoals op de beschikbaarheid van het weefsel. Celkweekmodellen zijn waarschijnlijk meer geschikt voor dat doel omdat ze gemakkelijker te hanteren en uitvoeren van een groot aantal prikkelingen op 10 dat het model beschrijven we efficiënter als het einde testen van kandidaat-behandelingen voordat de klinieken zou zijn. Bovendien is het tijdsbestek waarin we erin geslaagd zijn om de levensvatbaarheid van het weefsel te bewaren niet mogelijk voor experimenten die een lange bewaking periodes, zoals RNA-interferentie. Tenslotte wordt de bacteriële stimulatie in een normale incubator uitgevoerd en laat geen behoud of testen van het effect van anaërobe bacteriën. Het is onze bedoeling om te werken aan deze problemen in de toekomst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Erika Mileti voor een uitstekende technische ondersteuning en Dr Antonio Di Sabatino voor het verstrekken van zuurstof kamers.
Financiering: Dit werk werd ondersteund door subsidies van het 7e EU-kaderprogramma (IBDase, ERC: Dendroworld) en Fondazione Cariplo naar MR en ondersteuning door een Marie Curie internationale opleiding mobiliteit netwerk (Cross-Talk, subsidieovereenkomst nr: 21553-2) naar KT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 10X HBSS | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Peni/Strepto | Lonza | DE17602E | |
| Gentamycin | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| 100X ITS-X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17605E | |
| Non essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| Materials | |||
| Cloning cylinders 6x8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| Cloning cylinders 8x8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| Cloning cylinders 10x10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| Metal grids | Home made | ||
| Centre well organ culture plate | BD Falcon | 353037 | |
| Surgical glue (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Oxygen Jars | Home made | ||
| Oxygen tanks | Air Liquid Sanità | ||
References
- Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection. Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. , (2012).
- Tsilingiri, K., Rescigno, M. Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models? Gut Microbes. , Manuscript in preparation (2012).
- Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy. PLoS One. 4, e7056 (2009).
- Cencic, A., Langerholc, T. Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology--a review. Int. J. Food Microbiol. 141, Suppl 1. S4-S14 (2010).
- te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis. Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J. Anat. 134, 459-469 (1982).
- Browning, T. H., Trier, J. S. Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine. J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).
- Besselink, M. G., et al. Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 371, 651-659 (2008).
- Lakhdari, O., et al. Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356 (2011).
