Summary
हम कम से कम 24 घंटे से अधिक उत्तेजनाओं की विभिन्न प्रकार की प्रतिक्रिया की संस्कृति और निगरानी में मानव आंत्र mucosa के रखरखाव के लिए एक उपन्यास विधि परिचय. हमारे विधि के साथ, ऊतक के polarity शिखर मार्ग के माध्यम से एक शारीरिक उत्तेजना के लिए अनुमति दी जाती है.
Protocol
1. प्राप्त करने और ऊतक तैयारी
- ऊतक (स्वस्थ या IBD के म्यूकोसा) सर्जरी के दौरान प्राप्त की है. एक बार नमूना 4 डिग्री सेल्सियस पर या बर्फ पर पेन / Strep के साथ पूरक सीए + + / मिलीग्राम + मुक्त HBSS बफर में रखते हुए, जितनी जल्दी हो सके प्रयोगशाला को हस्तांतरण excised है.
नमूना के आकार * ऊतक की उपलब्धता पर निर्भर करता है: प्राप्त ऊतक का हिस्सा है, निदान के लिए आवश्यक नहीं है कि क्या सख्त है और स्वस्थ और IBD के विषयों के बीच भिन्न हो सकती हैं. स्वस्थ ऊतक पेट के कैंसर के लिए सर्जरी के दौर से गुजर रोगियों से excised है.
- धीरे ऊतक धो लें और सभी मेसेंतेरिक सामग्री से यह साफ है. एक पेट्री डिश (जरूरी immerged नहीं) में HBSS के बफर में ऊतक रखते हुए बाँझ कैंची और संदंश का उपयोग submucosa से म्यूकोसा परत अलग करें. संभव के रूप में छोटे रूप में संदंश के साथ mucosal सतह को स्पर्श करें.
- कम से कम 1 ग धारियों में म्यूकोसा कटमीटर चौड़ा और जब तक संभव हो. आप अपने भोजन काट रहे थे के रूप में हालांकि ज्यादा, दो बाँझ नलियां का प्रयोग करें.
- HBSS में धीरे म्यूकोसा साफ और ऊपर की ओर का सामना करना पड़ शिखर पक्ष के साथ एक पेट्री डिश पर यह विस्तार धो लें.
2. ऊतक बढ़ते
- ताजा मध्यम (tisDMEM) तैयार करें. DMEM के Glutamine (2 मिमी) और NaPyr (1 मिमी) के साथ पूरक का उपयोग करें, और FBS ना 15% जोड़ (भ्रूण गोजातीय सीरम - उत्तर अमेरिकी), 1% इसके-X और उपयोग के समय में 200 एनजी / एमएल EGF.
- एफबीएस ना (धातु ग्रिड पूरी तरह से जलमग्न हो जाएगा इतना है कि लगभग 30 मिलीलीटर का उपयोग) और डूब धातु ग्रिड के आराम के साथ एक 10 सेमी पेट्री डिश भरें. थाली अपने नल पर प्लास्टिक सिलेंडरों खुला और समर्थन रखें.
* धातु ग्रिड लोहे के बने होते हैं. मेष 0.5 मिमी का एक पक्ष के साथ वर्ग के आकार का है.
- एक 10 या 20 μl विंदुक के साथ सर्जिकल गोंद के 3 μl लो. यह च धारण करते हुए एक प्लास्टिक सिलेंडर की सीमाओं में से एक को ध्यान से लागू करेंसंदंश के साथ आईआरएम.
- धीरे यथासंभव निकट पट्टी की सीमाओं में से एक के लिए, म्यूकोसा के शिखर पक्ष पर सिलेंडर जगह है.
- अच्छी तरह से केंद्र में मध्यम के 850 μl-1 मिलीलीटर बांटना और थाली के केंद्रीय अच्छी तरह के किनारों पर धातु ग्रिड समर्थन: मजबूती ऊतक पर सिलेंडर को संलग्न करने के लिए गोंद समय देने के लिए केंद्र अच्छी तरह अंग संस्कृति की थाली तैयार करते हैं.
- दूर के रूप में पहले दो बाँझ नलियां उपयोग कर सिलेंडर की सीमाओं से अतिरिक्त ऊतक काटें.
- धीरे संलग्न ऊतक के साथ सिलेंडर उठा और थाली के बीच में धातु ग्रिड पर basolateral पक्ष जगह.
3. उत्तेजना
- अपनी पसंद की एकाग्रता में अपनी पसंद की उत्तेजनाओं का प्रयोग करें.
- पिपेट टिप के साथ सिलेंडर या mucosal सतह परेशान बिना प्लास्टिक सिलेंडर के केंद्र में उचित मात्रा लागू करें. अपने चुने मात्रा समान सिलेंडर के अंदर सतह शामिल सुनिश्चित करें. मेंdicated संस्करणों:
बड़े प्लास्टिक सिलेंडर: 200 μl
मध्यम प्लास्टिक सिलेंडर: 100 μl
छोटे प्लास्टिक सिलेंडर: 50 μl - ऊपर एक पारंपरिक इनक्यूबेटर में 3 घंटे के लिए सेते हैं.
* यदि आप लंबे समय के अंक के लिए सेते करना चाहते हैं, (3.5 देखें) आप उत्तेजनाओं की एक बहुत छोटी मात्रा (10-20 μl) का उपयोग सुनिश्चित करें और सीधे 1 एटीएम के दबाव में 100% 2 हे के माहौल में ऊतक जगह .
- शिखर चेहरे पर माध्यम की एक मोटी परत गैस विनिमय रोकता अगर ऊतक 2 हे पर्याप्त नहीं मिलता है, क्योंकि ऊतक के शिखर सतह से उत्तेजनाओं के साथ मध्यम लो और ताजा माध्यम के साथ की जगह नहीं है. प्लेट कवर.
- 1 एटीएम के दबाव में 100% 2 हे के माहौल में ऊतक रखें.
4. कटाई
- कुल संस्कृति समय (± 2.5 घंटे) के 24 घंटे के बाद सावधानी वें से सिलेंडर हटानेई एक छुरी धीरे scraping गोंद बंद की मदद से ऊतक और यह (आरएनए शुद्धि और जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा या प्रोटीन शुद्धीकरण और पश्चिमी धब्बा assays के लिए तरल एन 2 में immunohistochemistry और / या immunofluorescence assays है, या तस्वीर फ्रीज के लिए तय वांछित विश्लेषण के आधार पर की दुकान ).
- Cytokine स्राव रूपरेखा के लिए basolateral मध्यम हार्वेस्ट. गोली मलबे से 7 मिनट के लिए 8000 rpm पर अपकेंद्रित्र, एक Eppendorf ट्यूब (वैकल्पिक रूप से विभाज्य) में सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण और तुरंत -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
* यदि आप लंबे समय तक के लिए supernatants रखना चाहते हैं, -80 पर उन्हें दुकान डिग्री सेल्सियस
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Representative Results
हम ऊतक की भलाई के संरक्षण में कम से कम 24 घंटे के लिए संस्कृति में स्वस्थ और आईबीडी मानव आंत्र mucosa को बनाए रखने में सफल रहा. संस्कृति समय के बहुमत (कुल का कम से कम 85%) ओ 2 में जगह ले ली तो पिछले टिप्पणियों 1 के अनुसार, इस ऊतक पारंपरिक इन्क्यूबेटरों में 24 घंटे (चित्रा 2) के लिए जीवित नहीं था, के रूप में ही संभव था. हम भी explants के अलग प्रतिक्रियाएं उत्तेजना (शिखर बनाम basolateral) और उत्तेजनाओं 2,3 के प्रतिरक्षाजनकता के polarity के आधार पर इस मॉडल पर देखा जा सकता है कि पता चला है.
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम विभिन्न प्रोबायोटिक उपभेदों ऊतक की ओर से अलग प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना कर सकते हैं. लैक्टोबैसिलस plantarum NCIMB8826 स्वस्थ ऊतकों पर आश्चर्यजनक रूप immunogenic साबित हुई. दो अन्य Lactobacilli उपभेदों के विपरीत, यह करने के लिए lymphoid कोशिकाओं के प्रवास को उत्पन्न किया था, न केवल म्यूकोसा के बच्चों ऊपरवाला सतह, लेकिन यह भी महत्वपूर्ण इस प्रवास, CCl4, साथ ही आईएल -1 बी, परंपरागत समर्थक भड़काऊ गतिविधि से संबंधित एक साइटोकाइन के लिए प्रासंगिक एक केमोकाइन upregulated. हमारे आश्चर्य करने के लिए, भले ही हम पहले एल के एक निवारक कार्रवाई रखा था इस तनाव के जीवित बैक्टीरिया सूजन IBD के ऊतक पर लागू किया गया जब कोलाइटिस 4 के एक माउस मॉडल में paracasei, यह एक उपचारात्मक प्रभाव के लिए अनुवाद नहीं किया. बीमारी 2 की तीव्र चरण में आईबीडी म्यूकोसा पर इस्तेमाल किया जब बल्कि, सभी तीन उपभेदों हानिकारक साबित कर दिया.
इसके अलावा, हम आईबीडी म्यूकोसा 2 पर लागू जब एक ही समय में काफी सूजन ameliorates जबकि postbiotic नामक एक प्रोबायोटिक की चयापचय उत्पाद,,, बल्कि एक आक्रामक साल्मोनेला तनाव (FB62) के खिलाफ स्वस्थ उपकला परिरक्षण करने में सक्षम है कि पता चला है.
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चित्रा 1. के लिए समर्थन के रूप में इस्तेमाल किया धातु ग्रिड का सेट अप और तस्वीरों के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. एक. ऊपर की ओर से देखा सेट की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, बी. ऊपर, ग से देखा सेट की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. फोटो explant. सही ढंग से रखा है, केवल basolateral ओर केंद्रीय मध्यम चैम्बर, घ के साथ संपर्क में हो जाता है. पूरे कलाकारों की टुकड़ी की तस्वीर. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. ऊतक केवल 2 हे में संस्कृति बचता. ऑपरेटिंग कमरे से आगमन पर तय एक. असभ्य ऊतक,,
चित्रा 3 explants पर एक समर्थक भड़काऊ उत्तेजना का प्रभाव सी: संकेत समय अंक के लिए सभ्य unstimulated ऊतक, साल:.. ऊतक साल्मोनेला के साथ चुनौती दी है और संकेत समय अंक के लिए सुसंस्कृत. उपकला की ऊपरी परत के विनाश के पहले से ही 2 घंटा पर दिख रहा है. explant के 24 घंटे के बाद व्यापक अध: पतन प्रस्तुत करता है. मूल बढ़ाई: 10X.
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Discussion
मानव आंत्र mucosa के लिए उपचार सप्रमाण परीक्षण किया जा सकता है जिस पर physiologically प्रासंगिक मॉडल के लिए की जरूरत लंबे समय से जोर दिया गया है. कई शोधकर्ताओं ने उस प्रयोजन के लिए अब तक का इस्तेमाल सेल 5 और माउस मॉडल 6 दोनों में संभावित कलाकृतियों और दोषों की पहचान की है. होनहार preclinical डेटा अक्सर प्राप्त किया जाता है, भले ही दरअसल, ये शायद ही कभी महत्वपूर्ण चिकित्सीय लाभ के लिए अनुवाद.
इस काम में वर्णित विधि, संस्कृति और एक polarized फैशन में मानव आंत्र mucosa explants की उत्तेजना के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल 7, 8 से एक, अपेक्षाकृत सरल अभी तक प्रभावी और उपन्यास रूपांतर प्रस्तुत करता है.
इस मॉडल क्लीनिकों के लिए किसी भी तरह का एक संभावित उपचार लेने से पहले वैध पूर्व नैदानिक डेटा की पीढ़ी के लिए एक उत्कृष्ट पूरक दृष्टिकोण प्रदान कर सके. इस प्रकार, दुर्भाग्यपूर्ण नैदानिक परिणामों 9 संभावित बचा जा सकता है और शोधकर्ताओं ने अधिक कर सकतासुरक्षित रूप से तीव्र सूजन की स्थिति से निपटने के लिए क्लीनिक में उपचार को बढ़ावा देने.
मॉडल के बड़े फायदे ध्रुवीकृत बनाम गैर ध्रुवीकृत उत्तेजना तुलना करने के लिए और एक 24 घंटे की समय सीमा से अधिक ऊतक के जवाब का पालन करने की संभावना हैं. एक बहुत महत्वपूर्ण पैरामीटर हर प्रयोग में, विभिन्न उपचार के रोगियों के बीच खाता परिवर्तनीयता में लेने की अनुमति देता है जो एक ही रोगी से आ explants पर लागू होने वाली है. explants बायोप्सी की तुलना में एक अपेक्षाकृत बड़े आकार के तथ्य यह है कि यह भी विश्लेषण की एक किस्म के कई अलग अलग तरीकों (एलिसा assays के मात्रात्मक rtPCRs, माइक्रोएरे विश्लेषण, immunohistochemistry और / या इम्यूनोफ्लोरेसेंस में परिणामों की पुष्टि, एक ही explant पर प्रदर्शन किया जा सकता है डेटा). इसके अलावा, विश्लेषण के अन्य प्रकार cytofluorimetric analy द्वारा इस तरह उनके phenotype के उत्तेजित explants और मूल्यांकन से ब्याज की सेल आबादी की शुद्धि के रूप में, भविष्य में अनुकूलित किया जा सकता हैबहन.
हालांकि, ध्यान में रखा जाना करने के लिए महत्वपूर्ण सीमाएं भी हैं. यह ऊतक की उपलब्धता पर निर्भर करता है के रूप में अपने मौजूदा स्वरूप में इस मॉडल, उपचार की एक बड़ी संख्या के उच्च throughput प्रदर्शन के लिए उपयुक्त नहीं है. वे हम वर्णन मॉडल और अधिक कुशलता से क्लीनिक में प्रवेश करने से पहले उम्मीदवार उपचार के अंत परीक्षण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा जबकि 10 पर stimulations की एक बड़ी संख्या को संभालने और प्रदर्शन करने के लिए आसान कर रहे हैं के रूप में सेल संस्कृति मॉडल शायद उस उद्देश्य के लिए अधिक उपयुक्त हैं. इसके अलावा, हम ऊतक की व्यवहार्यता की रक्षा करने में सफल रहा है, जिसके दौरान समय सीमा के ऐसे शाही सेना के हस्तक्षेप के रूप में लंबे समय तक निगरानी अवधि, आवश्यकता के प्रयोगों के लिए अनुमति नहीं है. अंत में, बैक्टीरियल उत्तेजना एक नियमित इनक्यूबेटर में किया जाता है और anaerobic बैक्टीरिया के प्रभाव को बनाए रखने या परीक्षण के लिए अनुमति नहीं है. यह भविष्य में इन मुद्दों पर काम करने का इरादा है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम ऑक्सीजन कक्षों प्रदान करने के लिए उत्कृष्ट तकनीकी सहायता और डॉ. एंटोनियो डि Sabatino के लिए एरिका Mileti धन्यवाद.
धन: एमआर को और Fondazione Cariplo और एक मैरी क्यूरी अंतरराष्ट्रीय प्रशिक्षण गतिशीलता नेटवर्क (क्रॉस टॉक, अनुदान समझौता नहीं: 21553-2) द्वारा समर्थन करने के लिए: इस काम के 7 वें यूरोपीय संघ के ढांचे कार्यक्रम (Dendroworld IBDase, ईआरसी) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया के.टी..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 10X HBSS | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Peni/Strepto | Lonza | DE17602E | |
| Gentamycin | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| 100X ITS-X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17605E | |
| Non essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| Materials | |||
| Cloning cylinders 6x8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| Cloning cylinders 8x8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| Cloning cylinders 10x10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| Metal grids | Home made | ||
| Centre well organ culture plate | BD Falcon | 353037 | |
| Surgical glue (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Oxygen Jars | Home made | ||
| Oxygen tanks | Air Liquid Sanità | ||
References
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- Tsilingiri, K., Rescigno, M. Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models? Gut Microbes. , Manuscript in preparation (2012).
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