Intravaskulär perfusion av Carbon Black Ink Tillåter Pålitlig Visualisering av cerebrala kärl

Summary

Analys av gnagare cerebrovaskulär anatomi spelar en viktig roll i experimentell strokeforskning. I detta sammanhang har intravaskulära perfusion med färgad latex ansetts som ett standardverktyg i flera år. Detta innebär dock teknik distinkta tekniska begränsningar som undergräver dess reproducerbarhet. Här beskriver vi en enkel metod för att visualisera cerebrala kärl på ett reproducerbart sätt. Injektion av en blandning av två kommersiellt tillgängliga kolsvart bläck genom den vänstra ventrikeln myokardiala resulterar i adekvat fyllning av cerebrala kärl med hög kontrast visualisering. Vi har framgångsrikt tillämpat denna teknik för att identifiera anastomotiska punkter mellan cerebrala vaskulära territorier möss med olika genetiska bakgrunder. Vi ger slutligen bevis för att denna nya och enkel metod för fartyg färgning kan kombineras med trifenyltetrazoliumklorid (TTC) färgning – ett allmänt använt verktyg för att observera och analysera infarkt volymer i möss.

Abstract

Den anatomiska struktur cerebrala kärl är en viktig faktor för hjärnan hemodynamik samt svårighetsgraden av skada efter ischemiska förolämpningar. Den cerebrala kärl svarar dynamiskt till olika patofysiologiska tillstånd och det uppvisar stora skillnader mellan stammar och under förhållanden med genetiska manipulationer. I huvudsak, är en pålitlig teknik för intrakraniell fartyg färgning nödvändig för att studera patogenesen för ischemisk stroke. Tills nyligen har ett antal olika tekniker som använts för att visualisera den cerebrala vaskulaturen inklusive injektion av låg viskositet harts, Araldite F, gelatin blandat med olika färgämnen ¹ (dvs. karminröd, tusch) eller latex med ² eller ³ utan kimrök. Perfusion av vit latex föreningen genom den uppåtgående aortan har först rapporterades av Coyle och Jokelainen ^3. Maeda et al. ² har ändrat protokollet genom att lägga carbon svart bläck till latex föreningen för förbättrad kontrast visualisering av kärlen efter saltlösning perfusion av hjärnan. Emellertid ineffektiva perfusion och otillräcklig fyllning av fartygen ofta upplevt på grund av hög viskositet av latex föreningen ^4. Därför har vi beskrivit en enkel och kostnadseffektiv teknik som använder en blandning av två kommersiellt tillgängliga kolsvart bläck (CB1 och CB2) att visualisera den cerebrala vaskulaturen på ett reproducerbart sätt ^5. Vi har visat att perfusion med CB1 + CB2 i möss resulterar i färgning av betydligt mindre cerebrala kärl vid en högre densitet i jämförelse med latex perfusion ^5. Här beskriver vi vår protokoll för att identifiera de anastomotiska punkter mellan den främre (ACA) och mellersta cerebrala artärer (MCA) för att studera fartyg variationer i möss med olika genetiska bakgrunder. Slutligen visar vi genomförbarheten av vår teknik i en övergående fokal cerebral ischemi hos möss genom att kombinera CB1 +CB2-medierad kärl färgning med TTC färgning i olika grader av ischemiska skador.

Protocol

1. Djur Experiment utfördes i enlighet med NIH riktlinjer för vård och användning av laboratoriedjur och godkänd av lokala myndigheter. För alla experiment, C57BL6 / J vildtypmöss, ApolipoproteinE – / – (ApoE KO) och SV129 möss (12-16 veckor gamla, 26-30 g kroppsvikt, 5-6 djur per experimentgrupp) användes. 2. Färgning av cerebrala kärl med färgad latex Förbered en blandning av 25 | il kolsvart bläck (Herlitz, Tyskland) med 0,5 ml latex f?…

Representative Results

Protokollet som beskrivs här övervinner de tekniska begränsningarna hos konventionella latexbaserad visualisering av gnagare cerebral kärl. Figur 1A visar att efter perfusion av färgade latex, bara de stora fartyg på ventrala ytan är färgade, lämnar hela dorsala ytan ofärgade. Resultatet är också mycket varierande. Endast ett djur av sex visar partiell färgning av ACA och MCA synliga på den dorsala ytan av hjärnan (data visas ej). Omvänt CB1 + CB2 perfusion leder tillräckligt fyllning a…

Discussion

Perfusion av CB1 + CB2 genom manuell injektion kan utföras framgångsrikt av utan intensiv träning, eftersom det inte innebär någon specifik enhet innebära visst tryck ^2,3. Heterogenitet perfusion resultat i vår protokollet är också försumbar. Endast 1 djur av 16 icke-ischemiska djur och 3 av 20 ischemiska djur har visat ofullständig perfusion. I dessa fall, var införlivandet av bubblor under saltlösning perfusion leder till ocklusion av fartyg sannolikt orsaken till det misslyckade resultatet. </…

Materials

Name of reagent	Company Name	Catalog No.
Scribtol Schwarz (CB2)	Pelican, Germany	221 135
Stempelfarbe (CB1)	Herlitz PBS AG, Germany	10417202
Gedeo Latex	Pebeo, France	13042B