I ovo Elektroporation af miRNA-baserede plasmider i udviklingslandene neuralrøret og vurdering af fænotyper ved Dil Injection i Open-bog Forberedelser
Summary
En fremgangsmåde, hvorved genekspression i neuralrøret kan være nedreguleret i en celletype-specifik, sporbar måde beskrives. Vi viser, hvordan<em> In ovo</em> Elektroporation af microRNA-baserede plasmider, som fremkalder spatiotemporally styret RNA-interferens kan anvendes til at undersøge kommissurale Axon vejledning i den udviklende neuralrør.
Abstract
Kommissurale DI1 neuroner er blevet grundigt undersøgt for at belyse de mekanismer, der ligger til grund Axon vejledning under udvikling 1,2. Disse neuroner er beliggende i den dorsale rygmarv og sende deres axoner langs stereotype baner. Kommissurale axoner i første omgang rage ventralt mod og derefter på tværs af gulvpladen. Efter at have krydset midterlinjen gør disse axoner en skarp rostral sving og projekt på langs mod hjernen. Hvert af disse trin er reguleret af koordinerede aktiviteter tiltrækkende og frastødende vejledning cues. Den korrekte fortolkning af disse signaler er afgørende for vejledning af axoner langs deres afgrænsede bane. Således er den fysiologiske bidrag et givet molekyle til kommissurale axon vejledning ideelt undersøgt i forbindelse med levende embryo. Derfor skal gen knockdown in vivo styres præcist med henblik på at skelne omhyggeligt axon vejledningsaktiviteter af gener, der kan spille flereroller under udvikling.
Her beskriver vi en fremgangsmåde til knockdown genekspression i kyllingen neuralrøret i en celletype-specifik, sporbar måde. Vi anvender hidtil ukendte plasmidvektorer 3 huser celletype-specifikke promotorer / enhancere der driver ekspressionen af en fluorescerende protein-markør, efterfulgt direkte af en miR30-RNAi transcript 4 (placeret i 3'-UTR af det cDNA, der koder for det fluorescerende protein) ( figur 1). Når elektroporeret i det udviklende neuralrør, disse vektorer fremkalde effektive nedregulering af genekspression og udtrykke stærkt fluorescerende markørproteiner at muliggøre direkte sporing af cellerne oplever knockdown 3. Blande forskellige RNAi vektorer før elektroporering tillader samtidig knockdown af to eller flere gener i uafhængige regioner af rygmarven. Dette tillader komplekse cellulære og molekylære vekselvirkninger, der skal undersøges under udviklingen, på en måde, der er hurtig, sgen, præcis og billig. I kombination med Dil opsporing af kommissurale axon baner i open-book præparater 5, er denne metode et nyttigt værktøj for in vivo studier af de cellulære og molekylære mekanismer af kommissurale Axon vækst og vejledning. I princippet kan enhver promotor / enhancer kan anvendes, potentielt gør teknikken mere bredt anvendelig til in vivo-undersøgelser af genfunktion under udvikling 6.
Denne video først viser, hvordan man håndterer og vinduer æg, injektion af DNA plasmider i neuralrøret og elektroporation procedure. At undersøge kommissurale Axon vejledning, er rygmarven fjernet fra embryoet som en åben-book præparat, fikseret, og injiceret med Dil så axon veje kan spores. Rygmarven er monteret mellem dækglas og visualiseret ved hjælp af konfokal mikroskopi.
Protocol
Discussion
Denne enkle, vektorbaseret kunstige miRNA ekspression strategi kan anvendes til at knockdown endogen genekspression i kylling neuralrøret. Disse funktionelle værktøjer har multiple gen-nedregulering, tidsmæssig regulering og celletype specificitet, for at lette opklaringen af komplekse udviklingsmæssige forløb. Især har vi demonstreret anvendeligheden af disse plasmider i kommissurale Axon vejledning, eftersom plasmider kan anvendes til at knockdown forskellige gener i kommissurale neuroner eller i deres me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet i laboratoriet af ES er støttet af den schweiziske National Science Foundation. Vi vil gerne takke Dr. beat Kunz for at få hjælp med at filme.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| 0.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B120F-4 |
| Glass needle puller | Narishige | PC-10 |
| Electroporator | BTX | ECM 830 |
| Sylgard silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 |
| Tungsten wire, 0.075 mm | World Precision Instruments | TGW0325 |
| Insect pins, 0.20 mm | Fine Science Tools | 26002-20 |
| Insect pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Fast DiI | Molecular Probes | D-7756 |
| Fluorescent microscopes | Olympus | SZX12, BX51 |
References
- Chédotal, A. Further tales of the midline. Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).
- Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Development. 4, 21 (2009).
- Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. Cell type specific, traceable gene silencing for functional gene analysis during vertebrate neural development. Nucleic Acids Research. 39, e133 (2011).
- Das, R. M., van Hateren, N. J., Howell, G. R., Farrell, E. R., Bangs, F. K., Porteous, V. C. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental Biology. 294, 554-563 (2006).
- Perrin, F. E., Stoeckli, E. T. Use of lipophilic dyes in studies of axonal pathfinding in vivo. Microscopy Research and Technique. 48, 25-31 (2000).
- Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers. Genesis. 29, 123-132 (2001).
- Kieleczawa, J. Simple modifications of the standard DNA sequencing protocol allow for sequencing through siRNA hairpins and other repeats. Journal of Biomolecular Techniques. 16, 220-223 (2005).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Boulland, J., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo. J. Vis. Exp. (41), e2071 (2010).
- Kim, B. G., Dai, H. -. N., McAtee, M., Vicini, S., Bregman, B. S. Labeling of dendritic spines with the carbocyanine dye DiI for confocal microscopic imaging in lightly fixed cortical slices. Journal of Neuroscience Methods. 162, 237-243 (2007).
- Murphy, M. C., Fox, E. A. Anterograde tracing method using DiI to label vagal innervation of the embryonic and early postnatal mouse gastrointestinal tract. Journal of Neuroscience Methods. 163, 213-225 (2007).
- Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
- Li, X., Lufkin, T. Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III. Genesis. 26, 121-122 (2000).
- Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. e. n. e. Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).
- Cullen, B. R. Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments. Nature Methods. 3, 677-681 (2006).
