בelectroporation אובו של פלסמידים מירנה מבוססים ברכבת התחתית הפיתוח העצבי והערכת פנוטיפים ידי הזרקת DiI בהכנות-ספר פתוח
Summary
שיטה שבאמצעותה ביטוי גנים בצינור העצבי יכול להיות downregulated באופן ספציפי לסוג תא, מעקב מתוארת. אנחנו מדגימים איך<em> באוב</em> Electroporation של פלסמידים microRNA מבוססים שיעוררו התערבות RNA spatiotemporally מבוקרת יכול לשמש כדי לחקור הדרכת האקסון commissural בצינור העצבי פיתוח.
Abstract
dI1 נוירונים Commissural נחקרו רב על מנת להבהיר את המנגנונים בבסיס הדרכת האקסון במהלך 1,2 פיתוח. נוירונים אלה ממוקמים בחוט השדרה הגבה ולשלוח האקסונים שלהם לאורך מסלולים סטריאוטיפיים. אקסונים Commissural תחילה להקרין כלפי ventrally ולאחר מכן מעבר לfloorplate. אחרי שחצה את קו האמצע, אקסונים אלה לעשות תפנית חדה ומקורית פרויקט longitudinally לכיוון המוח. כל אחד משלב אלה מוסדר על ידי הפעילות המתואמת של רמזי הדרכה אטרקטיביות ודוחים. הפרשנות הנכונה של הרמזים הללו היא חיונית להדרכה של אקסונים לאורך המסלול המתוחם שלהם. לפיכך, התרומה הפיזיולוגית של מולקולה מסוימת להדרכת האקסון commissural הוא נחקר באופן אידיאלי בהקשר של החיים בהתהוותו. בהתאם לכך, מציאת גן בvivo חייבת להיות נשלטה במדויק כדי להבדיל פעילויות הדרכת האקסון של גנים שעשויים לשחק בזהירות מרובהתפקידים במהלך פיתוח.
כאן, אנו מתארים שיטה למציאת ביטוי גנים בצינור העצבי העוף באופן ספציפי לסוג תא, למעקב. אנו משתמשים בוקטורי פלסמיד רומן 3 מטפחים יזמי תאים ספציפיים לסוג / משפרים המניעים את הביטוי של סמן חלבון פלואורסצנטי, ואחרי ישירות על ידי תמליל miR30-RNAi 4 (הממוקם בתוך-UTR 3'של קידוד cDNA חלבון פלואורסצנטי) ( איור 1). כאשר electroporated לתוך הצינור העצבי פיתוח, הווקטורים האלה לעורר downregulation היעיל של ביטוי גנים ולבטא חלבוני סמני ניאון בוהקים כדי לאפשר מעקב ישיר של התאים חווים מציאה 3. ערבוב וקטורי RNAi שונים לפני electroporation מאפשר מציאה סימולטנית של שניים או יותר גנים באזורים עצמאיים של חוט השדרה. זה מאפשר אינטראקציות תאיות ומולקולריות מורכבות לבחינה במהלך פיתוח, באופן שהוא מהיר, שלimple, מדויק וזול. בשילוב עם DiI איתור של מסלולי האקסון commissural בהכנות של ספרים פתוחים 5, שיטה זו היא כלי שימושי עבור במחקרי vivo של מנגנונים התאיים ומולקולריים של צמיחת האקסון commissural והדרכה. בעיקרון, כל אמרגן / משפר יכול לשמש, באופן פוטנציאלי ביצוע הטכניקה מתאימה יותר נרחבת במחקרי vivo של תפקוד גן במהלך 6 פיתוח.
סרטון זה מדגים ראשון כיצד לטפל וביצים של חלונות, ההזרקה של פלסמידים DNA לתוך הצינור העצבי והליך electroporation. כדי לחקור הדרכת האקסון commissural, חוט השדרה הוא להסיר את העובר כהכנת ספר פתוח, קבוע, והוזרק לי DiI לאפשר מסלולי האקסון לנודעו עקבותיו. חוט השדרה הוא רכוב בין coverslips ודמיין באמצעות מיקרוסקופ confocal.
Protocol
Discussion
אסטרטגיה זו פשוטה, וקטור מבוססת מלאכותית מירנה ביטוי יכולה לשמש לביטוי גני מציאת אנדוגני בצינור העצבי העוף. כלים אלה תפקודיים להציע השתקת גנים מרובות, שליטה זמנית וספציפי תא מסוג, כדי להקל על ההבהרה של מסלולי התפתחות מורכבים. בפרט, אנו הוכחנו את התועלת של פלסמידים אל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה במעבדה של ES נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע השויצרית. ברצוננו להודות לד"ר Beat קונץ לקבלת סיוע בצילומים.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| 0.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B120F-4 |
| Glass needle puller | Narishige | PC-10 |
| Electroporator | BTX | ECM 830 |
| Sylgard silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 |
| Tungsten wire, 0.075 mm | World Precision Instruments | TGW0325 |
| Insect pins, 0.20 mm | Fine Science Tools | 26002-20 |
| Insect pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Fast DiI | Molecular Probes | D-7756 |
| Fluorescent microscopes | Olympus | SZX12, BX51 |
References
- Chédotal, A. Further tales of the midline. Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).
- Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Development. 4, 21 (2009).
- Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. Cell type specific, traceable gene silencing for functional gene analysis during vertebrate neural development. Nucleic Acids Research. 39, e133 (2011).
- Das, R. M., van Hateren, N. J., Howell, G. R., Farrell, E. R., Bangs, F. K., Porteous, V. C. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental Biology. 294, 554-563 (2006).
- Perrin, F. E., Stoeckli, E. T. Use of lipophilic dyes in studies of axonal pathfinding in vivo. Microscopy Research and Technique. 48, 25-31 (2000).
- Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers. Genesis. 29, 123-132 (2001).
- Kieleczawa, J. Simple modifications of the standard DNA sequencing protocol allow for sequencing through siRNA hairpins and other repeats. Journal of Biomolecular Techniques. 16, 220-223 (2005).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Boulland, J., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo. J. Vis. Exp. (41), e2071 (2010).
- Kim, B. G., Dai, H. -. N., McAtee, M., Vicini, S., Bregman, B. S. Labeling of dendritic spines with the carbocyanine dye DiI for confocal microscopic imaging in lightly fixed cortical slices. Journal of Neuroscience Methods. 162, 237-243 (2007).
- Murphy, M. C., Fox, E. A. Anterograde tracing method using DiI to label vagal innervation of the embryonic and early postnatal mouse gastrointestinal tract. Journal of Neuroscience Methods. 163, 213-225 (2007).
- Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
- Li, X., Lufkin, T. Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III. Genesis. 26, 121-122 (2000).
- Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. e. n. e. Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).
- Cullen, B. R. Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments. Nature Methods. 3, 677-681 (2006).
