In ovo Elektroporatie van miRNA gebaseerde Plasmiden in de ontwikkelingslanden neurale buis en Beoordeling van de fenotypes van Dil Injectie in de Open-boek Voorbereidingen
Summary
Een methode waarmee genexpressie in de neurale buis downgereguleerd in een celtype-specifieke, traceerbare wijze beschreven. We laten zien hoe<em> In-ovo</em> Elektroporatie van microRNA gebaseerde plasmiden spatiotemporeel gecontroleerde RNA interferentie opwekken kan worden gebruikt om commissurale axon begeleiding onderzoeken in ontwikkelingslanden neurale buis.
Abstract
Commissurale DI1 neuronen zijn uitgebreid bestudeerd om de mechanismen axon begeleiding bij ontwikkeling 1,2 helderen. Deze neuronen in de dorsale ruggenmerg en sturen hun axonen langs stereotype trajecten. Commissurale axonen in eerste instantie ventraal projecteren richting en dan over de vloerplaat. Na het oversteken van de middellijn, deze axonen maken een scherpe bocht rostrale en project lengterichting naar de hersenen. Elk van deze stappen wordt geregeld door de gecoördineerde activiteiten van aantrekkende en afstotende begeleiding cues. De juiste interpretatie van deze signalen is cruciaal voor de begeleiding van axonen langs hun afgebakende pad. Aldus wordt de fysiologische bijdrage van een bepaalde molecule te commissurale axon begeleiding voorkeur onderzocht in de context van de levende embryo. Bijgevolg moet gen knockdown in vivo nauwkeurig worden gecontroleerd om zorgvuldig onderscheid te maken axon begeleiding activiteiten van genen die kunnen spelen meerdererollen tijdens de ontwikkeling.
Hier beschrijven we een methode om knockdown genexpressie in de kip neurale buis op een celtype-specifieke, traceerbare wijze. We gebruiken novel plasmidevectoren 3 herbergen celtype-specifieke promoters / enhancers die de expressie van een fluorescerend eiwit marker rijden, direct gevolgd door een miR30-RNAi transcript 4 (binnen de 3'-UTR van het cDNA dat codeert voor het fluorescent protein) ( figuur 1). Wanneer geëlektroporeerd in het ontwikkelende neurale buis, deze vectoren efficiënt opwekken downregulatie van genexpressie en expressie helder fluorescente merker eiwitten kunnen direct traceren van de cellen ervaren knockdown 3. Het mengen van verschillende RNAi vectoren voor elektroporatie kan gelijktijdig knockdown van twee of meer genen in onafhankelijke delen van het ruggenmerg. Dit maakt complexe cellulaire en moleculaire interacties worden onderzocht tijdens de ontwikkeling, op een manier die snel, suitvoering, nauwkeurig en goedkoop. In combinatie met Dil tracing van commissurale axon trajecten in open-boek voorbereidingen 5, deze methode is een handig hulpmiddel voor in vivo studies van de cellulaire en moleculaire mechanismen van commissurale axongroei en begeleiding. In principe kan elke promoter / enhancer worden gebruikt, mogelijk waardoor de techniek breder toepasbaar voor in vivo studies van genfunctie tijdens de ontwikkeling 6.
Deze video toont eerst hoe naar en venster eieren, de injectie van DNA plasmiden in de neurale buis en de elektroporatie procedure. Om commissurale axon begeleiding te onderzoeken, wordt het ruggenmerg verwijderd van het embryo als een open boek voorbereiding, vast, en geïnjecteerd met Dil zodat axon paden te traceren. Het ruggenmerg wordt tussen dekglaasjes en gevisualiseerd met behulp van confocale microscopie.
Protocol
Discussion
Deze eenvoudige vector-gebaseerde kunstmatige miRNA expressie strategie kan worden gebruikt om knockdown endogene genexpressie in de kip neurale buis. Deze functionele tools bieden meerdere gene silencing, tijdelijke controle en cel-type specificiteit, de interpretatie van complexe ontwikkelingstrajecten te vergemakkelijken. In het bijzonder hebben we aangetoond dat de bruikbaarheid van deze plasmiden in commissurale axon leiding, aangezien de plasmiden kunnen worden gebruikt om verschillende genen knockdown in commissu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Werken in het lab van ES wordt ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation. We willen graag Dr Beat Kunz bedanken voor hulp bij het filmen.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| 0.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B120F-4 |
| Glass needle puller | Narishige | PC-10 |
| Electroporator | BTX | ECM 830 |
| Sylgard silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 |
| Tungsten wire, 0.075 mm | World Precision Instruments | TGW0325 |
| Insect pins, 0.20 mm | Fine Science Tools | 26002-20 |
| Insect pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Fast DiI | Molecular Probes | D-7756 |
| Fluorescent microscopes | Olympus | SZX12, BX51 |
References
- Chédotal, A. Further tales of the midline. Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).
- Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Development. 4, 21 (2009).
- Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. Cell type specific, traceable gene silencing for functional gene analysis during vertebrate neural development. Nucleic Acids Research. 39, e133 (2011).
- Das, R. M., van Hateren, N. J., Howell, G. R., Farrell, E. R., Bangs, F. K., Porteous, V. C. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental Biology. 294, 554-563 (2006).
- Perrin, F. E., Stoeckli, E. T. Use of lipophilic dyes in studies of axonal pathfinding in vivo. Microscopy Research and Technique. 48, 25-31 (2000).
- Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers. Genesis. 29, 123-132 (2001).
- Kieleczawa, J. Simple modifications of the standard DNA sequencing protocol allow for sequencing through siRNA hairpins and other repeats. Journal of Biomolecular Techniques. 16, 220-223 (2005).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Boulland, J., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo. J. Vis. Exp. (41), e2071 (2010).
- Kim, B. G., Dai, H. -. N., McAtee, M., Vicini, S., Bregman, B. S. Labeling of dendritic spines with the carbocyanine dye DiI for confocal microscopic imaging in lightly fixed cortical slices. Journal of Neuroscience Methods. 162, 237-243 (2007).
- Murphy, M. C., Fox, E. A. Anterograde tracing method using DiI to label vagal innervation of the embryonic and early postnatal mouse gastrointestinal tract. Journal of Neuroscience Methods. 163, 213-225 (2007).
- Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
- Li, X., Lufkin, T. Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III. Genesis. 26, 121-122 (2000).
- Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. e. n. e. Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).
- Cullen, B. R. Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments. Nature Methods. 3, 677-681 (2006).
