<sub> 1</sub> F<sub> O</sub> ATPase Vesicle Voorbereiding en Techniek for Performing Patch Clamp Recordings van Submitochondrial Vesicle Membranen
Summary
Werkwijze voor submitochondrial vesicles verrijkt F1FO ATP synthase complexen rattenhersenen isolaat wordt beschreven. Deze vesicles kunnen de studie van de activiteit van F1FO ATPase complex en de modulatie met de techniek van patch clamp opname.
Abstract
Mitochondriën zijn betrokken bij vele belangrijke cellulaire processen, waaronder het metabolisme, overleving 1, ontwikkeling, calcium signalering 2. Twee van de belangrijkste mitochondriale functies gerelateerd aan de efficiënte productie van ATP, de energie-eenheid van de cel, door oxidatieve fosforylering en bemiddeling van signalen voor geprogrammeerde celdood 3.
Het enzym primair verantwoordelijk voor de productie van ATP is F1FO ATP-synthase, ook wel ATP synthase 4-5. De afgelopen jaren is de rol van mitochondriën in apoptotische en necrotische celdood aanzienlijke aandacht gekregen. In apoptotische celdood, BCL-2 familie eiwitten zoals Bax voer de mitochondriale buitenste membraan, oligomerize en permeabilize de buitenste membraan, het vrijgeven van pro-apoptotische factoren in het cytosol 6. In klassieke necrotische celdood, zoals die welke door ischemie of excitotoxiciteit in neuronen, eee, slecht gereguleerde toename matrix calcium bijdraagt aan de opening van de binnenste membraan poriën, de mitochondriale permeabiliteittransitieporie of MPTP. Dit depolariseert de binnenste membraan en veroorzaakt osmotische verschuivingen, bij te dragen aan buitenste membraan breuk, vrijgave van pro-apoptotische factoren, en metabole stoornissen. Veel eiwitten waaronder Bcl-xL 7 interageren met F1FO ATP synthase, modulerende zijn functie. Bcl-xL interageert direct met de beta-subeenheid van F1FO ATP synthase, en deze interactie neemt een lek geleiding binnen de F1FOATPasecomplex, het verhogen van de netto transport van H + door F1FO tijdens F1FO ATPase activiteit 8 en waardoor mitochondriale efficiëntie. Om de activiteit en de modulatie van de ATP synthase bestuderen, we geïsoleerd van knaagdierhersenen submitochondrial blaasjes (SMVS) met F1FO ATPase. De SMVS behouden de structurele en functionele integriteit van de F1FO ATPase zoals in Alavian et al.. Hier beschrijven we een werkwijzedat we met succes gebruikt voor de isolatie van SMVS uit rattenhersenen en we bakenen de patch clamp techniek kanaalactiviteit analyseren (ion lekkage geleidbaarheid) van de SMVS.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hierin beschreven werkwijzen kan de isolatie van zuivere mitochondria eind van stap 1 en submitochondrial vesicles (SMVS) na stap 2 van volledige hersenen zonder onderscheid cel phenotypes.SMVspurified met deze methode in hoofdzaak vrij is van andere subcellulaire organellen zoals in Figuur 1 en onze eerdere werk (Alavian KN et al.. 8) en voorafgaand aan het bevriezen van hun structurele en functionele integriteit te behouden. Na invriezen en ontdooien, die mitochondria of SMVS wo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | Company | Catalogue number |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | |
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | |
| Digidata 1440A | Molecular Device | |
| pClamp10.0 | Molecular Device | |
| Manipulator | Sutter Instrument | |
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
- Duchen, M. R., et al. Mitochondria and calcium in health and disease. Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).
- Lemasters, J. J. Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism. J. Gastroenterol. Hepatol. 22, S31-S37 (2007).
- Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit. Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).
- Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits. Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).
- Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).
- Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis. Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).
- Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).
- Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
- Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities. J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).
- Young, H. K. o., Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. Mitochondrial ATP Synthasomes. J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).
