<sub> 1</sub> F<sub> O</sub> АТФазы Подготовка пузырька и техника исполнительских патч зажим Записи субмитохондриальных мембран везикул
Summary
Способе выделения пузырьков субмитохондриальных обогащенный F1FO АТФ-синтазы комплексов из мозга крысы описано. Эти пузырьки позволяют изучение активности АТФазы F1FO комплекса и его модуляции с использованием техники записи патч зажима.
Abstract
Митохондрии участвуют во многих важных клеточных функций, включая метаболизм, выживание 1, развитие и, кальциевой сигнализации 2. Два из наиболее важных функций митохондрий связаны с эффективного производства АТФ, энергия валюты из клетки, по окислительного фосфорилирования, и посредством сигналов запрограммированной клеточной смерти 3.
Фермент в первую очередь отвечает за производство АТФ F1FO-АТФ-синтазы, которая также называется АТФ-синтазы 4-5. В последние годы, роль митохондрий в апоптозе и некротической гибели клеток получила значительное внимание. В апоптоза, BCL-2 семьи белки, такие как Bax введите митохондриальные наружной мембраны, олигомеризоваться и проницаемыми внешнюю мембрану, высвобождая проапоптотические факторов в цитозоль 6. В классическом некротической гибели клеток, такие как отходы ишемии или эксайтотоксичностью в нейронах, крупе, плохо регулируется увеличение матрицы кальций способствует открытию внутреннего пор мембраны, митохондриальных пор переход проницаемости или МРТР. Это деполяризует внутренней мембраны и вызывает осмотические сдвиги, способствующие разрыву внешней мембраны, выпуск проапоптотические факторы и метаболические дисфункции. Многие белки, включая Bcl-XL 7 F1FO взаимодействовать с АТФ-синтазы, модулирующей функции его. Bcl-X L непосредственно взаимодействует с бета-субъединицы АТФ-синтазы F1FO, и это взаимодействие уменьшается утечка проводимость в F1FOATPasecomplex, увеличение чистой переноса Н + на F1FO в течение F1FO АТФазы 8 и тем самым увеличивая митохондриальной эффективности. Для изучения активности и модуляция АТФ-синтазы, мы изолированы от грызунов мозговых пузырей субмитохондриальных (SMVs), содержащий F1FO АТФазы. SMVs сохранить структурную и функциональную целостность F1FO АТФазы, как показано на Alavian соавт. Здесь мы описываем способчто мы успешно используется для изоляции SMVs из мозга крысы, и мы разграничить технику патч зажим для анализа активности канала (ионная проводимость утечки) из SMVs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанные здесь способы включить выделение чистой митохондрий в конце стадии 1 и субмитохондриальных везикулы (SMVs) после шага 2 от всего головного мозга без различия клетки phenotypes.SMVspurified этим методом, по существу свободный от загрязнения другими субклеточные органеллы, как показано <stron…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | Company | Catalogue number |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | |
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | |
| Digidata 1440A | Molecular Device | |
| pClamp10.0 | Molecular Device | |
| Manipulator | Sutter Instrument | |
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
- Duchen, M. R., et al. Mitochondria and calcium in health and disease. Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).
- Lemasters, J. J. Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism. J. Gastroenterol. Hepatol. 22, S31-S37 (2007).
- Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit. Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).
- Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits. Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).
- Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).
- Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis. Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).
- Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).
- Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
- Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities. J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).
- Young, H. K. o., Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. Mitochondrial ATP Synthasomes. J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).
