<sub> 1</sub> F<sub> O</sub> ATPas vesikelberedning och teknik for Performing Patch Clamp Inspelningar av Submitochondrial Blås Membran
Summary
En metod för att isolera submitochondrial vesiklar anrikade i F1FO ATP-syntas-komplex från råtthjärna beskrivs. Dessa blåsor tillåter studier av aktiviteten hos F1FO ATPas komplex och dess modulering användning av tekniken med patch clamp inspelning.
Abstract
Mitokondrier är inblandade i många viktiga cellulära funktioner inklusive metabolism, överlevnad 1, utveckling och, kalcium signalering 2. Två av de viktigaste mitokondriella funktioner är relaterade till effektiv produktion av ATP, den energi valuta i cellen, genom oxidativ fosforylering, och förmedling av signaler för programmerad celldöd 3.
Enzymet primärt ansvarig för produktionen av ATP är den F1FO-ATP-syntas, även kallad ATP-syntas 4-5. Under de senaste åren har betydelsen av mitokondrier i apoptotiska och nekrotiska celldöd fått stor uppmärksamhet. I apoptotiska celldöd, BCL-2 familjen proteiner såsom Bax in den mitokondriella yttre membranet, oligomerisera och permeabilize yttre membran, släpper proapoptotiska faktorer i cytosolen 6. I klassisk nekrotisk celldöd, såsom den som produceras av ischemi eller excitotoxicitet i nervceller, en large, dåligt reglerade ökning matrix kalcium bidrar till öppnandet av ett inre membran por, den mitokondriella permeabilitet övergången pore eller MPTP. Detta depolariserar det inre membranet och orsakar osmotiska skift, bidrar till yttre membran bristning, frisättning av pro-apoptotiska faktorer, och metabolisk dysfunktion. Många proteiner innefattande Bcl-Xl 7 interagerar med F1FO ATP-syntas, modulera dess funktion. Bcl-xL interagerar direkt med betasubenheten av F1FO ATP-syntas, och denna interaktion minskar läckage konduktans inom F1FOATPasecomplex, ökar netto transport av H + från F1FO under F1FO ATPas aktivitet 8 och därigenom öka mitokondriell effektivitet. Att studera aktiviteten och modulering av ATP-syntas, isolerade vi från submitochondrial gnagare hjärnan blåsor (SMVs) innehåller F1FO ATPas. De SMVs bibehåller den strukturella och funktionella integriteten hos F1FO ATPas såsom visas i Alavian et al. Här beskriver vi en metodatt vi har framgångsrikt använts för att isolera SMVs från råtthjärna och vi avgränsa tekniken patch clamp att analysera kanal aktivitet (jon läcka konduktans) av SMVs.
Protocol
Representative Results
Discussion
De metoder som beskrivs häri möjliggör isolering av rent mitokondrier vid slutet av steg 1 och submitochondrial vesiklar (SMVs) efter steg 2 från hela hjärnan utan åtskillnad av cell phenotypes.SMVspurified genom denna metod är i huvudsak fri från föroreningar av andra subcellulära organeller, såsom visas i Figur 1 och vårt tidigare arbete (Alavian KN et al. 8) och bibehåller sin strukturella och funktionella integritet före frysning. Efter frysning och upptining, isole…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | Company | Catalogue number |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | |
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | |
| Digidata 1440A | Molecular Device | |
| pClamp10.0 | Molecular Device | |
| Manipulator | Sutter Instrument | |
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
- Duchen, M. R., et al. Mitochondria and calcium in health and disease. Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).
- Lemasters, J. J. Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism. J. Gastroenterol. Hepatol. 22, S31-S37 (2007).
- Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit. Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).
- Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits. Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).
- Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).
- Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis. Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).
- Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).
- Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
- Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities. J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).
- Young, H. K. o., Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. Mitochondrial ATP Synthasomes. J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).
