CyTOF 질량 cytometer의 성능의 일상 튜닝 및 최적화에 필요한 단계에 설명되어 있습니다. 최적의 샘플 준비와 유량의 댓글이 논의
Abstract
최근 몇 년 동안, 단일 세포의 급속한 분석은 일반적으로 유동 세포 계측법과 휘황-라벨 항체를 사용하여 수행되었습니다. 그러나, 형광 방출의 스펙트럼 중복의 문제는 동시 프로브의 수를 제한하고 있습니다. 반면, 오히려 fluorophores보다 ICP-MS. 1 액체 단일 셀 도입 시스템 DVS 과학 커플의 새로운 CyTOF 질량 cytometer는 매우 강화 금속 동위 원소를 포함하는 킬레이트 화 고분자는 항체 또는 기타 특정 프로브에 연결된다. 2-5가 때문에 금속 순도와 질량 cytometer의 대량 해상도, 인근 동위 원소로부터 "스펙트럼 중복"은 없습니다, 따라서 보상 매트릭스 필요. 또한, 란탄 족 금속의 사용으로 인해, autofluorescence 대한 동등한 따라서 거기에는 생물학적 배경이 없습니다합니다. 원자 질량 103-203, 이론적으로 최대 100 레이블이 동시에 구별 할 수에 걸쳐 대량 창을 갖추고 있습니다. 현재, 35 개 이상의 채널 샘플 면역 프로파일의 전례 절개를 허용 DVS 과학에서 사용할 수있는 킬레이트 시약을 사용하여 사용할 수 있습니다. 6-7
대량 세포 계측법에 단점은 프로브 당 별도의 금속 동위 원소 (앞으로 또는 측면 분산 가능성이 이에 상응하는 금액),하고 파괴적인 기술 (복구를 정렬의 어떠한 가능성)이라는 사실에 대한 엄격한 요구 사항이 포함되어 있습니다. 대량 cytometer의 현재 구성도 만의 셀 전송 속도 ~ 25 %, 따라서 세포의 높은 입력 번호를 필요가 있습니다.
대량 cytometer의 최적의 일일 실적은 몇 가지 단계가 필요합니다. 최적화의 기본 목표는 M 신호 강도를 줄이고 M 16에서 원하는 신호를 방해한다는 산화물 (M 16)의 형성을 최소화하면서 원하는 금속 동위 원소 (M)의 측정 신호 강도를 극대화하는 것입니다. 첫 번째 단계는 시스템 때문에 고온, 안정적 I을 따뜻하게하는 것입니다CP 플라즈마가 설립되었습니다. 둘째, 현재와 메이크업 가스 유량에 대한 설정은 매일 최적화해야합니다. 샘플 수집하는 동안, 최대 셀 이벤트 요금은 검출기 효율과 처리 속도 1,000 세포 / 초에 의해 제한됩니다. 그러나, 느린 셀 이벤트 속도 (300-500 셀 / 초)은 샘플의 품질에 따라 보통 셀 이벤트 사이하므로 더 나은 해상도가 doublets와 파편을 통해 그대로 singlets을 극대화 할 수 있도록하는 것이 바람직하다. 마지막으로 하루의 끝에 기계의 적절한 청소는 무료 금속에 의한 배경 신호를 최소화하는 데 도움이됩니다.
Protocol
CyTOF의 모든 세포 샘플은 고정 permeabilized해야합니다. 이 이리듐 함유 DNA의 intercalator의 큰 항목을 가능하게하고, 또한 대량 cytometer에 주입하기 전에 즉시 MilliQ 물 세척 및 resuspension 단계 동안 세포 용해를 방지 할 수 있습니다. 1. 시작 – 최대 질량 Cytometer의 CyTOF 소프트웨어 프로그램을 엽니 다. 악기 설정을 선택합니다. 카드 케이지 탭에서 오른쪽 하단 모서리로 ?…
Representative Results
위의 프로토콜을 따르면 네 가지를 달성해야합니다. 첫째, 대량 cytometer를위한 충분한 워밍업 시간을 허용하는 것은 최적의 신호와 최소한의 산화물 형성에 필요한 뜨거운, 안정적 플라즈마를 생성합니다. MilliQ 물과 DVS 워시 솔루션 (그림 9)와 대량 cytometer의 두 번째, 적절한 세척은 (그림 8) 샘플 수집하는 동안 배경을 감소하는 데 도움이, 금속 흡착의 수준 튜브와 기계의…
Discussion
지난 몇 수십 년 동안 형광 유동 세포 계측법은 표면 표현의 측면과 기능 assays에서 모두 단일 세포를 분석 주력 방법이었습니다. 그러나, 형광 염료의 스펙트럼 중복의 문제가 동시에 마커의 수를 제한하고 있습니다. 12 개 이상의 동시 마커를 사용하여 실험이보고 된 반면, 필요한 보상의 양이 기술적으로 어려워집니다.
대신 fluorophores의, 대량 세포 계측법은 항체에 대한 라?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 피드백을 박사 에반, 뉴웰 박사 숀 Bendall 감사드립니다. 우리는 또한 멀티 란탄 족 함유 폴리스티렌 구슬의 샘플에 대한 DVS 과학 박사 숀 Bendall 감사드립니다. 우리는 NIH 보조금이 U19 AI057229에서 자금에 감사합니다.
Materials
Name of the reagent
Company
Catalogue number
Comments
CyTOF mass cytometer
DVS Sciences
Wash solution
DVS Sciences
201071
0.05% hydrofluoric acid in water
Tuning solution
DVS Sciences
201072
0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace nitric acid
Eu-containing polystyrene beads
DVS Sciences
201073
Contains natural-abundance Eu isotopes; beads supplied at approximately 1 million/ml
Contains natural-abundance isotopes of listed lanthanides
Nitric acid (concentrated)
Fisher Scientific
A467-500
Optima trace-metal pure ICP-MS grade
Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap-5 ml
BD
352235
used to filter cell samples before injection
Norm-Ject tuberkulin syringe-1 ml
Henke Sass Wolf
4010-200V0
silicone-free, latex-free
Norm-Ject syringe-3 ml
Henke Sass Wolf
4010.000V0
silicone-free, latex-free
MilliQ water
18 MΩ pure water; must not be stored in glass or plastic bottles that have been washed with commercial detergent (due to their high levels of barium present).
Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer. J. Vis. Exp. (69), e4398, doi:10.3791/4398 (2012).