Kütle Sitometri: Bir CyTOF Kütle Sitometre Daily Tuning ve Koşu Hücre Örnekleri için protokol
Summary
Bir CyTOF kitle sitometresinin performans günlük ayarlama ve optimizasyon için gerekli adımlar açıklanmaktadır. Optimum numune hazırlama ve akış hızı Comments on tartışılır
Abstract
Son yıllarda, tek hücrelerin hızlı analiz genellikle akış sitometrisi ve floresan-etiketli antikorlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ancak, fluorofor emisyon spektral örtüşme sorunu eşzamanlı probların sayısını sınırladı. Buna karşılık, daha çok floroforlar göre bir ICP-MS. 1 bir sıvı tek hücreli giriş sistemi DVS Sciences çiftler tarafından yeni CyTOF kütle sitometresinde yüksek oranda zenginleştirilmiş metal şelatlama izotopları ihtiva eden polimerler, antikorlar ya da başka özel problar ile birleştirilir. 2-5 Çünkü metal saflık ve kitle sitometresinin kütle çözünürlüğü, komşu izotoplar hiçbir "spektral örtüşme" olduğunu ve bu nedenle tazminat matrisler gerek. Buna ek olarak, lantanit metallerinin kullanımına bağlı olarak, otoflöresans herhangi bir eşdeğer bu nedenle hiçbir biyolojik arka plan ve. Atomik kütle 103-203, teorik olarak en fazla 100 etiket eşzamanlı ayırtedilebilecektir kapsayan kitlesel bir pencere bulunmaktadır. Şu anda, 35'ten fazla kanalı örneklerin immünolojik profili görülmemiş diseksiyonu izin DVS Bilimler edinilebilir şelatlama reaktifler kullanılarak kullanılabilir. 6-7
Kitle sitometri için Dezavantajları prob başına ayrı bir metal izotop (ileri veya yan dağılım hiçbir eşdeğeri) ve yıkıcı bir tekniktir (kurtarma sıralama ihtimalinin) olması için sıkı gereksinimi vardır. Kütle sitometresinin akım konfigürasyonu, aynı zamanda tek bir hücre iletim hızı ~% 25, ve böylece hücrelerin daha yüksek giriş numarası gerektiren sahiptir.
Kitle sitometresinin Optimal günlük performans birkaç adım gerektirir. Optimizasyon temel hedefi M sinyal yoğunluğu azaltmak ve M +16 de istenilen sinyal ile müdahale edeceğini oksitler (M +16) oluşumunu azaltırken istenen metal izotopları (M) ölçülen sinyal yoğunluğunun maksimize etmektir. İlk adım, makinenin çok sıcak, istikrarlı Ben ısınmak içinCP plazma kurulmuştur. İkincisi, güncel ve makyaj gaz akış hızı ayarlarına günlük olarak optimize edilmelidir. Numune toplama sırasında yüksek hücre olay hızı detektörü verim ve işlem hızı 1000 hücre / dakika ile sınırlıdır. Bununla birlikte, daha düşük bir hücre olay oranı (300-500 hücre / saniye), örnek kalitesine bağlı olarak, genellikle hücre olaylar arasında ve böylece daha iyi bir çözünürlüğe çiftler çifti ve kalıntı fazla bozulmadan singlet en üst düzeye izin vermek için arzu edilir. Son olarak, günün sonunda makinenin uygun temizleme serbest metale bağlı olarak arka plan sinyali en aza indirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Son birkaç yıldır, floresans akış sitometri yüzey ekspresyonu açısından ve fonksiyonel testleri, hem tek hücre analizi için bir beygir yöntem olmuştur. Ancak, floresan boyalar spektral örtüşme sorunları eşzamanlı belirteçlerin sayısını sınırladı. 12'den fazla eşzamanlı işaretleyiciler kullanılarak deneyler bildirilmiştir ederken, gerekli tazminat miktarı bu teknik zorlaştırmaktadır.
Bunun yerine florofor, kitle sitometri antikorları için etiket gibi m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz geribildirim Dr Evan Newell ve Dr Sean Bendall teşekkür etmek istiyorum. Biz de Multi-lantanit içeren polistiren boncuklar bir örnek için DVS Bilimler ve Doktor Sean Bendall teşekkür etmek istiyorum. Biz NIH hibe 2 U19 AI057229 fon için minnettarız.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| CyTOF mass cytometer | DVS Sciences | ||
| Wash solution | DVS Sciences | 201071 | 0.05% hydrofluoric acid in water |
| Tuning solution | DVS Sciences | 201072 | 0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace nitric acid |
| Eu-containing polystyrene beads | DVS Sciences | 201073 | Contains natural-abundance Eu isotopes; beads supplied at approximately 1 million/ml |
| Multi-lanthanide-containing (La/Pr/Tb/Tm/Lu)- polystyrene beads | DVS Sciences | Not yet commercially-available | Contains natural-abundance isotopes of listed lanthanides |
| Nitric acid (concentrated) | Fisher Scientific | A467-500 | Optima trace-metal pure ICP-MS grade |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap-5 ml | BD | 352235 | used to filter cell samples before injection |
| Norm-Ject tuberkulin syringe-1 ml | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | silicone-free, latex-free |
| Norm-Ject syringe-3 ml | Henke Sass Wolf | 4010.000V0 | silicone-free, latex-free |
| MilliQ water | 18 MΩ pure water; must not be stored in glass or plastic bottles that have been washed with commercial detergent (due to their high levels of barium present). | ||
| Citranox | Sigma-Aldrich | Z273236 | acid detergent |
| Argon gas | Praxair | AR 5.0UH-T | 99.999% Ultra-high purity |
References
- Bandura, D. R. Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).
- Lou, X. Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays. Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).
- Majonis, D. Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain. Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).
- Leipold, M. D. Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination. Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).
- Bendall, S. C. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Newell, E. W. Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes. Immunity. 36, 142-152 (2012).
