לכידה סלקטיבית של 5-hydroxymethylcytosine מהדנ"א הגנומי
Summary
תאר הוא תהליך תיוג שני שלבי שימוש (β-GT) β-glucosyltransferase להעביר תזיד-גלוקוז ל5-HMC, ואחרי לחץ כימיה להעביר מקשר ביוטין להעשרה קלה וצפיפות בלתי תלויה. שיטת תיוג יעילה וספציפית זו מאפשרת העשרה של 5-HMC עם רקע נמוך ביותר ומיפוי epigenomic תפוקה גבוהה באמצעות רצף של הדור הבא.
Abstract
5-methylcytosine (5-MC) מהווה ~ 2-8% מכלל cytosines בהדנ"א הגנומי אדם ומשפיע על מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים, כולל ביטוי גנים, שמירה על שלמות הגנום, החתמה הורית, איון כרומוזום ה-X, רגולציה של פיתוח, הזדקנות וסרטן 1. לאחרונה, הנוכחות של חומץ 5-MC, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), התגלתה בתאי יונקים, ובעיקר בתאי גזע עובריים (ES) ותאים עצביים 2-4. 5-HMC נוצר על ידי חמצון של 5-MC קטליזאטור ידי ט משפחת הברזל (ב ') / dioxygenases α-ketoglutarate התלוי 2, 3. 5-HMC מוצע להיות מעורב בתחזוקה של תא גזע עוברי (MES), hematopoiesis וממאירויות הרגילים, והזיגוטה פיתוח 2, 5-10. כדי להבין טוב יותר את התפקוד של 5-HMC, מערכת רצף אמינה וישירה היא חיונית. רצף יסולפיט מסורתי לא מבחין בין 5-5-HMC מMC 11 </sup>. כדי להסביר את הביולוגיה של 5-HMC, פתח גישה כימית יעילה מאוד סלקטיבית לתייג וללכוד 5-HMC, תוך ניצול של אנזים bacteriophage שמוסיף מחצית סוכר ל5-HMC במיוחד 12.
כאן אנו מתארים הליך פשוט שני שלבים לתיוג כימי סלקטיבית של 5-HMC. בשלב התיוג 1, 5-HMC בהדנ"א הגנומי מתויג עם קטליזאטור 6-יזיד-גלוקוז על ידי β-GT, glucosyltransferase מbacteriophage T4, באופן שמעביר את 6-תזיד-גלוקוז ל5-HMC מ העדכון cofactor, UDP-6-N3-GLC (6-N3UDPG). בצעד, biotinylation השני, מקשר ביוטין דיסולפיד מצורף לקבוצה יזיד ידי לחץ כימיה. שני פעולות ספציפיות ויעילות ביותר, שמובילות לתיוג להשלים ללא קשר לשפע של 5-HMC באזורים גנטיים ונותנים רקע נמוך ביותר. בעקבות biotinylation של 5-HMC, שברי 5-DNA המכיל HMC אז הם כבשו סלקטיביבאמצעות חרוזי streptavidin באופן עצמאי בצפיפות. שברי 5-HMC מועשרי DNA המתקבלים יכולים לשמש עבור ניתוחים במורד זרם, כוללים רצף של הדור הבא.
התיוג סלקטיבית שלנו ופרוטוקול לכידה מקנים רגישות גבוהה, החלה על כל מקור של הדנ"א הגנומי עם שכיחות משתנית / 5-HMC מגוון. אמנם המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא יישומה במורד הזרם (כלומר., הדור הבא של רצף למפות את התפלגות 5-HMC בגנום), זה תואם עם מולקולה בודדה, SMRT (DNA) רצף בזמן אמת, שהוא מסוגל לספק רזולוצית רצף יחיד בסיס של 5-HMC.
Protocol
Discussion
5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) הוא הווה שינוי epigenetic זיהה לאחרונה בכמויות ניכרות בסוגי תאי יונקים מסוימים. השיטה שהוצגה כאן היא לקביעת חלוקת הגנום של 5-HMC. אנו משתמשים bacteriophage T4 β-glucosyltransferase להעביר מחצית גלוקוז מהונדסת המכילה קבוצה תזיד על קבוצת הידרוקסיל של 5-HMC. הקבוצה תזיד יכולה לה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות (GM071440 לCH וNS051630/MH076090/MH078972 לPJ).
Materials
| Name | Company | Catalog # | Comment |
| Reagents | |||
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Promega | V4221 | |
| 0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | V4231 | |
| 1M Trizma base (Tris) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
| HEPES 1M, pH7.4 | Invitrogen | 15630 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | |
| DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate | Click Chemistry Tools | A112P3 | |
| 1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Micro Bio-Spin 6 Column | Bio-Rad | 732-6222 | |
| Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
| Streptavidin C1 | |||
| Qiagen MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| UDP-6-N3-glucose | Active Motif | 55013 | |
| Enzyme | |||
| β-glucosyltransferase (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
| Equipment | |||
| Sonication device | Covaris | ||
| Desktop centrifuge | |||
| Water bath | Fisher Scientific | ||
| Gel running apparatus | Bio-Rad | ||
| NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
| Labquake Tube Shaker | Barnstead | ||
| Labquake Tube Shaker | Thermolyne | ||
| Magnetic Separation Stand | Promega | Z5342 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20). |
References
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. , 245-254 (2003).
- Ito, S. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466, 1129-1133 (2010).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
- Ko, M. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Koh, K. P. Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).
- Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).
- Wossidlo, M. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nat. Commun. 2, 241 (2011).
- Gu, T. P. The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes. Nature. 477, 606-610 (2011).
- Dawlaty, M. M. Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development. Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).
- Huang, Y. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One. 5, e8888 (2010).
- Song, C. X. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).
- Pastor, W. A. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473, 394-397 (2011).
- Matarese, F., Pau, C. a. r. r. i. l. l. o. -. d. e. S. a. n. t. a., E, ., Stunnenberg, H. G. 5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block. Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).
- Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).
- Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes. Biochemistry. , (2012).
- Rusmintratip, V., Sowers, L. C. An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).
- Globisch, D. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
- Yildirim, O. Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells. Cell. 147, 1498-1510 (2011).
- Szulwach, K. E. Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells. PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).
- Szulwach, K. E. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).
