Selektiv Capture av 5-hydroxymethylcytosine fra genomisk DNA

Summary

Beskrevet er en to-stegs etiketteringsprosessen hjelp β-glucosyltransferase (β-GT) for å overføre en azid-glukose til 5-HMC, etterfulgt av klikk kjemi å overføre en biotin linker for enkel og tetthet uavhengig berikelse. Denne effektive og spesifikke merking metoden muliggjør berikelse av 5-HMC med ekstremt lav bakgrunn og høy gjennomstrømning epigenomic kartlegging via neste generasjons sekvensering.

Abstract

5-methylcytosine (5-mC) utgjør ~ 2-8% av de totale cytosines i humant genomisk DNA og påvirker et bredt spekter av biologiske funksjoner, inkludert genekspresjon, vedlikehold av genom integritet, foreldrenes imprinting, X-kromosom inaktivering, regulering av utvikling, aldring og kreft ^en. Nylig, ble tilstedeværelsen av et oksydert 5-MC, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), oppdaget i pattedyrceller, spesielt i embryonale stamceller (ES-celler) og neuronale celler ^2-4. 5-HMC genereres ved oksidasjon av 5-mC katalysert av TET family jern (II) / α-ketoglutarat-avhengige ^{2 dioxygenases, 3.} 5-HMC er foreslått å være involvert i vedlikehold av embryonale stamceller (MES) celle, normal hematopoiesis og maligniteter, og zygote utvikling ^{2, 5-10.} For bedre å forstå funksjonen av 5-HMC, er en pålitelig og grei sekvensering system viktig. Tradisjonell bisulfite sekvensering kan ikke skille 5-HMC fra 5-mC ¹¹ </sup>. Å løse biologi 5-HMC, har vi utviklet en svært effektiv og selektiv kjemiske tilnærming til å merke og ta 5-HMC, dra nytte av en bakteriofag enzym som legger en glukose moiety til 5-HMC spesielt ^12.

Her beskriver vi en grei totrinns prosedyre for selektiv kjemisk merking av 5-HMC. I det første trinnet merking, er 5-HMC i genomisk DNA merket med en 6-azide-glukose katalysert av β-GT, en glucosyltransferase fra T4 bakteriofag, på en måte som overfører 6-azide-glukose til 5-HMC fra modifisert cofaktor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). I det andre trinn, biotinylation, en disulfid biotin linkerarm festet til azid-gruppen ved klikk kjemi. Begge trinnene er meget spesifikke og effektive, fører til fullstendig merking uansett overflod av 5-HMC i genomisk regioner og gi ekstremt lav bakgrunn. Etter biotinylation av 5-HMC, de 5-HMC-holdige DNA-fragmenter blir deretter selektivt fangetbruker streptavidin perler i en tetthet-uavhengig måte. De resulterende 5-HMC-beriket DNA fragmenter kan bli brukt for nedstrøms analyser, inkludert neste generasjons sekvensering.

Vår selektiv merking og fangst protokollen confers høy følsomhet, gjelder enhver kilde til genomisk DNA med variable / diverse 5-HMC abundances. Selv om hovedformålet med denne protokollen er dens nedstrøms søknaden (ie., Neste generasjons sekvensering å kartlegge 5-HMC distribusjon i genomet), er den kompatibel med single-molekyl, real-time SMRT (DNA) sekvensering, som er stand til å levere ett-grunnoppløsningen sekvensering av 5-HMC.

Protocol

1. Genomisk DNA fragmentering Fragment genomisk DNA ved hjelp av sonikering i et ønsket størrelsesområde egnet for genom-wide sekvensering plattform. (Vi vanligvis sonicate til ~ 300 bp). Verifiser størrelsesfordelingen av den fragmenterte genomisk DNA på 1% agarosegel (figur 1). 2. DNA Forberedelse Bestem utgangsmaterialene DNA beløp basert på overflod av 5-HMC i genomisk DNA. Siden 5-HMC-nivåene varierer betydel…

Discussion

5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) er et nylig identifisert epigenetic modifikasjon tilstede i betydelige mengder i visse pattedyr celletyper. Metoden som presenteres her er for å bestemme genom-wide distribusjon av 5-HMC. Vi bruker T4 bakteriofag β-glucosyltransferase å overføre en konstruert glukose moiety inneholdende en azide gruppe på hydroksylgruppen av 5-HMC. Azidet gruppen kan være kjemisk modifisert med biotin for deteksjon, affinitet berikelse, og sekvensering av 5-HMC-holdige DNA-fragmenter i pattedyr geno…

Materials

Name	Company	Catalog #	Comment
			Reagents
5M Sodium chloride (NaCl)	Promega	V4221
0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Promega	V4231
1M Trizma base (Tris) pH7.5	Invitrogen	15567-027)
HEPES 1M, pH7.4	Invitrogen	15630
Magnesium chloride (MgCl2) 1M	Ambion	AM9530G
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418
Tween 20	Fisher BioReagents	BP337-100
DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate	Click Chemistry Tools	A112P3
1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure	Invitrogen	15508-013
QIAquick Nucleotide Removal Kit	Qiagen	28304
Micro Bio-Spin 6 Column	Bio-Rad	732-6222
Dynabeads MyOne	Invitrogen	650-01
Streptavidin C1
Qiagen MinElute PCR Purification Kit	Qiagen	28004
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500500
UDP-6-N3-glucose	Active Motif	55013
			Enzyme
β-glucosyltransferase (β-GT)	New England Biolab	M0357
			Equipment
Sonication device	Covaris
Desktop centrifuge
Water bath	Fisher Scientific
Gel running apparatus	Bio-Rad
NanoDrop1000	Thermo Scientific
Labquake Tube Shaker	Barnstead
Labquake Tube Shaker	Thermolyne
Magnetic Separation Stand	Promega	Z5342
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen
			Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20).