Utarbeidelse av Cell-linjer for betinget Knockdown av Gene Expression og måling av Knockdown Effekter på E4orf4-indusert celledød
Summary
Bidrag av ACF kromatin remodeling faktor til E4orf4-indusert celledød ble målt. Protokollen inkluderer valg av cellekloner hvori doksycyklin behandling induserer betinget knockdown av ACF subenheter Acf1 og SNF2h, og bruk av DAPI analysen å måle E4orf4-indusert celledød i induserbare cellelinjer.
Abstract
Funksjonell inaktivering av genuttrykk i mammalske celler er avgjørende for studiet av bidraget av et protein av interesse for ulike veier 1,2. Imidlertid er betinget knockdown av genekspresjon kreves i tilfeller når konstitutive knockdown ikke er tolerert av celler for en lang tidsperiode 3-5. Her beskriver vi en protokoll for utarbeidelse av cellelinjer slik betinget knockdown av subenheter av ACF kromatin remodeling faktor. Disse cellelinjer lette fastsettelsen av bidraget fra ACF til induksjon av celledød ved adenovirus E4orf4 protein 6. Sekvenser som koder korte hårnål RNAS for Acf1 og SNF2h subenheter av ACF kromatin remodeling faktor ble klonet ved siden av en doksycyklin-induserbar promoter i et plasmid som også inneholder et gen for neomycin resistens-genet. Neomycin-resistente cellekloner ble selektert i nærvær av G418 og isolert. De resulterende cellelinjer ble indusert veddoksycyklin behandling, og en gang Acf1 eller SNF2h ekspresjonsnivåer ble redusert, ble cellene transfektert med et plasmid som koder E4orf4 eller tom vektor. For å bekrefte den spesifikke effekten av shRNA konstruerer, ble Acf1 eller SNF2h protein nivåer restaurert til WT nivåer ved cotransfection med et plasmid uttrykker Acf1 eller SNF2h som ble gjengitt resistente mot shRNA ved innføring av tause mutasjoner. Evnen E4orf4 å indusere celledød i de ulike prøvene ble bestemt ved en DAPI assay hvori frekvensen av utseendet atomkjerner med apoptotiske morfologier i transfekterte cellepopulasjon ble målt 7-9.
Protokollen beskrevet her kan benyttes for bestemmelse av den funksjonelle bidraget av ulike proteiner til induksjon av celledød ved deres protein partnerne i tilfeller når konstitutive knockdown kan være celle dødelige.
Protocol
Discussion
Knockdown av spesifikke genuttrykk er en viktig tilnærming til etterforskningen av bidraget av et protein til regulatoriske veier. Siden konstituerende knockdown av uttrykk for viktige gener virker negativt celleproliferasjon, kan deres studie krever enten forbigående innføring av siRNAs eller anvendelsen av stabile betinget knockdown systemer. Generering av stabile cellelinjer med kapasitet for narkotika-indusert ekspresjon av shRNAs beskrevet her, gir en fordel fremfor transiente transfeksjoner som kanskje ikke er …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet (delvis) av Israel Science Foundation (Grant 399/11), ved Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) innenfor rammen av Den tysk-israelske Prosjekt Samarbeid (DIP), og ved Rappaport Family Institute for Research in Medisinsk fakultet.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| doxycycline | Sigma | D9891 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference. Cancer. 2, 243-247 (2002).
- Czauderna, F. Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model. Nucleic acids research. 31, e127 (2003).
- Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns. Nucleic acids research. 31, e77 (2003).
- Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. Journal of. 77, 8957-8961 (2003).
- Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes. Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).
- Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway. J. Virol. 75, 789-798 (2001).
- Shtrichman, R., Kleinberger, T. Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells. J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).
- Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B’ subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba. Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).
- Galluzzi, L. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).
- Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk. J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).
- Li, S. The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells. Oncogene. 28, 390-400 (2009).
- Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -. C., Robert, A. Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases. J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).
