التصوير pHluorin الموسومة الإدراج مستقبلات غشاء البلازما إلى الخلايا العصبية في الابتدائية الماوس مثقف
Summary
من علامات المجالات خارج الخلية من مستقبلات الغشاء مع pHluorin superecliptic، والتصوير هذه المستقبلات في الخلايا العصبية الماوس الانصهار مثقف، يمكننا تصور الأحداث مباشرة الفردية الإدراج حويصلي في المستقبلات إلى غشاء البلازما. هذه التقنية سوف يكون مفيدا في توضيح الآليات الجزيئية التي تحكم الإدراج مستقبلات للغشاء البلازما.
Abstract
A فهم أفضل للآليات التي تحكم الاتجار مستقبلات بين غشاء البلازما (PM) ومقصورات داخل الخلايا يتطلب المنهج التجريبي مع ممتازة الدقة المكانية والزمانية. وعلاوة على ذلك، يجب أن هذا النهج أيضا لديها القدرة على التمييز المستقبلات المترجمة على PM عن تلك الموجودة في حجرات داخل الخلايا. الأهم من ذلك، كشف المستقبلات في حويصلة واحدة يتطلب المعلقة حساسية الكشف، لأن كل حويصلة يحمل سوى عدد قليل من المستقبلات. نهج قياسية لدراسة الاتجار مستقبلات تشمل biotinylation سطح تليها الكشف الكيمياء الحيوية، والتي تفتقر إلى كل القرارات اللازمة المكانية والزمانية، ومضان المجهري الفحص من المستقبلات السطحية immunolabeled، الأمر الذي يتطلب التثبيت الكيميائي للخلايا وبالتالي تفتقر إلى القرار الزمنية الكافية 1-6. للتغلب على هذه القيود، وضعنا وغيرهم وتوظيف سترا جديدةtegy أن تمكن من التصور الدينامي للمستقبلات الإدراج في قرارات PM مع ممتازة المكانية والزمانية 7-17. يشمل النهج علامات من GFP درجة الحموضة حساسة، وpHluorin superecliptic 18، إلى المجال N-محطة خارج الخلية من المستقبلات. Superecliptic pHluorin له خاصية فريدة من كونها الفلورسنت في الرقم الهيدروجيني محايدة وغير الفلورسنت، في الرقم الهيدروجيني الحمضية (الرقم الهيدروجيني <6.0). ولذلك، فإن مستقبلات المفتاحية هي غير الفلورسنت عندما الحمضية داخل التجويف من الحويصلات الاتجار داخل الخلايا أو الأجزاء endosomal، وتصبح بسهولة تصور فقط عندما تتعرض للبيئة محايد الرقم الهيدروجيني خارج الخلية، على السطح الخارجي للPM. استراتيجيتنا يسمح بالتالي لنا أن نميز بين مستقبلات سطح PM من داخل تلك الحويصلات الاتجار داخل الخلايا. لتحقيق ما يكفي من القرارات المكانية والزمانية، وكذلك الحساسية اللازمة لدراسة الاتجار ديناميكية من المستقبلات، قمنا بتوظيف الداخلية تعكس إجماليأيون المجهر الفلورسنت (TIRFM)، والتي مكنتنا من تحقيق القرار الأمثل المكاني للتصوير الضوئي (~ 170 نانومتر)، والقرار الزمني للفيديو معدل المجهري (30 إطارات / ثانية)، وحساسية للكشف عن مضان GFP من واحد جزيء. عن طريق التصوير pHluorin الموسومة تحت المستقبلات TIRFM، كنا قادرين على تصور الأحداث مباشرة الفردية الإدراج في مستقبلات الخلايا العصبية مثقف PM في. يمكن أن يحتمل هذا النهج التصوير تطبيقها على أي بروتين الغشاء مع مجال خارج الخلية التي يمكن أن يكون المسمى مع pHluorin superecliptic، وسوف تسمح تشريح آليات مفصلة الرئيسية التي تحكم الإدراج من البروتينات الغشاء مختلفة (المستقبلات، وقنوات أيون، نقل، الخ) ل وPM.
Protocol
Discussion
لأسباب غير معروفة، الخلايا العصبية الماوس دائما أكثر صعوبة من الخلايا العصبية في الثقافة الفئران. في تجربتنا، وثقافة مختلطة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية يعمل بشكل جيد لالخلايا العصبية الأولية الماوس مثقف. ومع ذلك، هذه الثقافة المختلطة ليست مناسبة للتجارب ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل من جانب صناديق بدء التشغيل من مختبر جاكسون.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| purified bovine collagen solution (Purecol) | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 14185-045 | |
| penicillin-streptomycin (Pen Strep) | GIBCO | 15140-122 | |
| sodium pyruvate | GIBCO | 11360-070 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO | 10313-021 | |
| fetal bovine serum (FBS) | |||
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| papain | Worthington Biochemical Corp. | LS003126 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase I) | SIGMA | DN25-10MG | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-144 | |
| 0.05% trypsin | GIBCO | 25300-054 | |
| poly-l-lysine hydrobromide | SIGMA | P2636-1G | |
| boric acid | Fisher-Scientific | BP 168-500 | |
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | GIBCO | 17504-044 | |
| heat inactive horse serum | GIBCO | 26050-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 019 | |
| HEPES | Fisher-Scientific | BP310-500 | |
| Culture Insert | Millipore | PICM03050 |
References
- Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
- Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic. Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).
- Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA. Neuron. 71, 1022-1029 (2011).
- Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK. EMBO J. 27, 361-372 (2008).
- Lin, D. T., Huganir, R. L. PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization. J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).
- Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites. Neuron. 47, 709-723 (2005).
- Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation. 12, 879-887 (2009).
- Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).
- Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor. Journal of Neuroscience. , (2012).
- Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion. J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).
- Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane. Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).
- Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).
- Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs. J. Neurosci. 24 (AMPARs), 5172-5176 (2004).
- Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses. J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).
- Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, 381-390 (2009).
- Makino, H., Malinow, R. Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience. Neuron. 72, 1001-1011 (2011).
- Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135, 535-548 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
