הדמית pHluorin-תויגה הכנסת קולט לממברנה הפלזמה בנוירונים עכבר מתורבתים ראשיים
Summary
על ידי תיוג התחומים התאיים של קולטנים בממברנה עם pHluorin superecliptic, ועל ידי הדמית קולטנים היתוך אלה בתרבית תאי עצב של עכבר, אנו יכולים לחזות אירועים ישירות החדרת שלפוחי בודדים של הקולטנים לממברנת הפלזמה. טכניקה זו תהיה סייעה להבהרת המנגנונים המולקולריים השולטים הכנסת קולט לממברנת הפלזמה.
Abstract
הבנה טובה יותר של מנגנונים המסדירים את הסחר בין קולט הפלזמה ממברנה (PM) והתאים תאיים דורשת גישה ניסויית להחלטות מרחב ובזמן מצוינים. יתר על כן, גישה כזו יש גם יש יכולת להבחין קולטנים מותאמים בצהריים מאלו בתאים תאיים. והכי חשוב, גילוי קולטנים בשלפוחית אחת דורש רגישות גילוי יוצאת דופן, שכן כל שלפוחית נושא רק מספר קטן של קולטנים. גישות סטנדרטיות לבחינת סחר קולט כוללות biotinylation פני שטח בעקבות זיהוי ביוכימי, שאין לו לא את ההחלטות דרושות מרחב ובזמן; ובדיקת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של הקולטנים immunolabeled, אשר דורשים קיבוע כימי של תאים ולכן לוקה ברזולוציה הטמפורלית מספיקה 1-6. כדי להתגבר על המגבלות האלה, אנחנו ואחרים פתחנו והעסקנו Stra חדשtegy המאפשר הדמיה של ההחדרה הדינמית של קולטנים לשעה עם רזולוציות מרחב ובזמן מצוינים 7-17. הגישה כוללת תיוג של ה-GFP-pH רגישה, 18 pHluorin superecliptic, לתחום התאי N-המסוף של הקולטנים. Superecliptic pHluorin יש את המאפיין הייחודי של הניאון ב-pH הניטראלי ולא ניאון ב-pH חומצי (pH <6.0). לכן, את הקולטנים המתויגים הם כאשר אנשים שאינם ניאון בתוך לומן חומצי של שלפוחית סחר תאי או תאי endosomal, והם הופכים בקלות דמיינו רק כאשר הם נחשפים לסביבת ה-pH הניטראלית התאית, על פני השטח החיצוניים של ראש הממשלה. האסטרטגיה שלנו וכתוצאה מכך מאפשרת לנו להבחין הקולטנים PM מאלה בתוך שלפוחית סחר תאית. כדי להשיג החלטות מספיק מרחב ובזמן, כמו גם את הרגישות הנדרשת כדי ללמוד סחר דינמי של קולטנים, שהועסקנו כולל פנימי משקףמיקרוסקופיה יון הניאון (TIRFM), שאפשר לנו להשיג הרזולוציה מרחבית האופטימלית של דימות אופטי (~ 170 ננומטר), ההחלטה הזמנית של מיקרוסקופיה וידאו שיעור (30 מסגרות / שני), ואת הרגישות לגילוי קרינה של ה-GFP אחת מולקולה. על ידי הדמית pHluorin-תויג תחת קולטנים TIRFM, הצליחו ישירות לדמיין אירועי הכנסת קולט בודדים לתוך PM בנוירונים בתרבית. גישת הדמיה זו יכולה באופן פוטנציאלי להיות מיושמת על כל חלבון קרום בתחום תאי שאפשר לתייג עם pHluorin superecliptic, ותאפשר נתיחה של המנגנונים המפורטים המרכזיים שמנחים החדרה של חלבוני קרום שונים (קולטנים, תעלות יונים, מובילים, וכו ') כדי PM.
Protocol
Discussion
מסיבות שאינן ידועות, הנוירונים עכבר הם תמיד קשים יותר לתרבות מאשר תאי עצב בעכברים. מניסיוננו, תרבות מעורבת של תאי עצב וגליה עובדת היטב עבור נוירונים עכבר תרבית ראשוניים. עם זאת, תרבות כזו מעורבת אינה מתאימה לניסויי TIRF הדמיה, כמו בסוג זה של נוירונים התרבות והתהליכים של…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי קרני אתחול ממעבדת ג'קסון.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| purified bovine collagen solution (Purecol) | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 14185-045 | |
| penicillin-streptomycin (Pen Strep) | GIBCO | 15140-122 | |
| sodium pyruvate | GIBCO | 11360-070 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO | 10313-021 | |
| fetal bovine serum (FBS) | |||
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| papain | Worthington Biochemical Corp. | LS003126 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase I) | SIGMA | DN25-10MG | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-144 | |
| 0.05% trypsin | GIBCO | 25300-054 | |
| poly-l-lysine hydrobromide | SIGMA | P2636-1G | |
| boric acid | Fisher-Scientific | BP 168-500 | |
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | GIBCO | 17504-044 | |
| heat inactive horse serum | GIBCO | 26050-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 019 | |
| HEPES | Fisher-Scientific | BP310-500 | |
| Culture Insert | Millipore | PICM03050 |
References
- Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
- Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic. Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).
- Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA. Neuron. 71, 1022-1029 (2011).
- Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK. EMBO J. 27, 361-372 (2008).
- Lin, D. T., Huganir, R. L. PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization. J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).
- Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites. Neuron. 47, 709-723 (2005).
- Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation. 12, 879-887 (2009).
- Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).
- Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor. Journal of Neuroscience. , (2012).
- Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion. J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).
- Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane. Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).
- Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).
- Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs. J. Neurosci. 24 (AMPARs), 5172-5176 (2004).
- Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses. J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).
- Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, 381-390 (2009).
- Makino, H., Malinow, R. Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience. Neuron. 72, 1001-1011 (2011).
- Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135, 535-548 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
