Barwy Pasażowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych linii Trypsyna

Summary

W tym filmie pokazujemy, jak w naszym laboratorium rutynowo fragmenty barwy linii ludzkich zarodkowych komórek macierzystych, z trypsyny.

Abstract

W tym filmie pokazujemy, jak w naszym laboratorium rutynowo fragmenty barwy linii ludzkich zarodkowych komórek macierzystych, z trypsyny. Ludzkich zarodkowych komórek macierzystych są artefakty hodowli komórek i mają tendencję do nabywania karyotypic nieprawidłowości z wysokiej podwojeń populacji. Właściwa pasaży jest niezbędna dla utrzymania zdrowego, niezróżnicowane, karyotypically normalne odcienie ludzkich macierzystych embrionalnych hodowli komórkowej. Po pierwsze, kultura rozwija przemyto w PBS w celu usunięcia resztek mediów i resztek komórek, a następnie komórkową zalewamy niewielką ilość ciepła 0,05% trypsyny-EDTA. Trypsyna jest w lewo na komórki do pięciu minut, a następnie komórki są delikatnie wypadają z 2 ml pipety serologiczne. Zawiesiny komórek są zbierane i mieszane z dużą ilością odcieni media, następnie komórki są zbierane przez delikatne wirowanie. Inaktywowane trypsyny mieszanki mediów jest usuwany, a komórki zawieszano w ogrzana barwy mediów. Odpowiedniego współczynnika podziału jest obliczana (zazwyczaj 1:10 do 1:20), a komórki ponownie wysiano na 1-2 dni stare płyty zawierające monowarstwy napromieniowanych myszy embrionalnych komórek podajnik fibroblastów. Nowo zasiane kultury barwy płyta jest w nienaruszonym stanie przez 48 godzin, a następnie wymiany nośnika na co dzień później. Ważne jest, aby nie trpsinize do pojedynczej zawiesiny komórek, ponieważ zwiększa to ryzyko wprowadzenia karyotypic nieprawidłowości.

Protocol

Ogólny Zalecamy rozmrożeniu nie więcej niż jednej próbki w danym czasie, aby zapewnić łatwą obsługę. Obsługi należy uważać, aby nie pozostawić kultur w temperaturze pokojowej i CO2 niskie przez długi okres czasu. Wszystkie wirowania żywych komórek odbywa się w temperaturze 500-600 xg przez 5 min w temperaturze pokojowej. MEFs (mysz zarodkowych komórek Feeder) Pre-ciepłe mediów MEF do 37 ° C. Usuń fiolki MEF od -80 ° C i natychmia…

Discussion

W tym filmie pokazaliśmy, w jaki sposób rutynowo barwy fragment linii ludzkich zarodkowych komórek macierzystych w laboratorium. Sprawne i regularne dzielenie i pasaży jest niezbędna dla utrzymania zdrowego linii ludzkich zarodkowych komórek macierzystych. Przejście pośredniczy Trypsyna jest znaczącą przewagę odcieni linii komórkowych, jednak ważne jest nie do ponad trypsinize kultur i mieć duży udział pojedynczych komórek podczas ponownego Platting.

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 ml GlutaMAXTM 6.5 ml NEAA 6.5 ml 2‐mercaptoethanol 0.5ul KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 ml bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml