Passage af Hues humane embryonale stamceller-linjer med Trypsin

Summary

I denne video viser vi, hvordan vores laboratorium rutinemæssigt passager farvetone humane embryonale stamcellelinjer med trypsin.

Abstract

I denne video viser vi, hvordan vores laboratorium rutinemæssigt passager farvetone humane embryonale stamcellelinjer med trypsin. Humane embryonale stamceller er artefakter i cellekultur, og har tendens til at erhverve karyotypic abnormiteter med høje populationsfordoblinger. Korrekt passager er afgørende for at opretholde en sund, udifferentieret, karyotypically normal Hues humane embryonale stamceller kultur. For det første er en ekspanderende kultur vasket i PBS for at fjerne resterende medier og cellerester, og derefter celler overlejret med et minimalt volumen af ​​varm 0,05% trypsin-EDTA. Trypsin efterlades på cellerne op til fem minutter, hvorefter cellerne forsigtigt løsnes med en 2 ml serologisk pipette. Cellesuspensionen opsamles og blandes med et stort volumen af ​​nuancer medier, der derefter opsamles cellerne ved forsigtig centrifugering. Den inaktiverede trypsin mediet Blandingen fjernes, og cellerne resuspenderet i forvarmet farvetone medier. En passende fordeling beregnes (generelt fra 1:10 til 1:20), og cellerne igen udpladet på en 1-2 dage gammelplade indeholdende et monolag af bestrålede muse embryonale fibroblaster fødeceller. Den nyligt podes farvetoner dyrkningsplade efterlades uforstyrret i 48 timer, hvorefter mediet skiftes hver dag derefter. Det er vigtigt ikke at trpsinize ned til en enkelt cellesuspension, da dette øger risikoen for at indføre karyotypic abnormiteter.

Protocol

General Vi anbefaler optøning ikke mere end én prøve på et givent tidspunkt for at sikre nem håndtering. Føreren skal sørge for ikke at forlade kulturer ved stuetemperatur og lav CO2 i lange perioder ad gangen. Alle centrifugering af levende celler sker ved 500-600 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. MEF'er (muse embryonale fødeceller) Præ-varme MEF medier til 37 ° C. Fjerne MEF hætteglasset fra -80 ° C og straks nedsænke den nederste h…

Discussion

I denne video har vi vist, hvordan vi rutinemæssigt passage farvetone humane embryonale stamcellelinjer i vores laboratorium. Effektiv og regelmæssig opdeling og passage er afgørende for at opretholde en sund humane embryonale stamceller linje. Trypsin medieret passage er en betydelig fordel af nuancer cellelinier, men det er vigtigt ikke at over Trypsinisér kulturer eller at have en stor del af enkelte celler under re-platting.

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 ml GlutaMAXTM 6.5 ml NEAA 6.5 ml 2‐mercaptoethanol 0.5ul KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 ml bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml