Passaging Hues humane embryonale stamcelle-linjer med Trypsin

Summary

I denne videoen viser vi hvordan vår lab rutinemessig luftveiene fargetoner humane embryonale stamcellelinjer med trypsin.

Abstract

I denne videoen viser vi hvordan vår lab rutinemessig luftveiene fargetoner humane embryonale stamcellelinjer med trypsin. Humane embryonale stamceller er gjenstander av cellekultur, og har en tendens til å erverve karyotypic unormalt med høy befolkningstetthet doblinger. Riktig passaging er avgjørende for å opprettholde en sunn, udifferensiert, karyotypically normal Hues menneskelige embryonale stamceller kultur. Først blir en ekspanderende kultur vasket i PBS for å fjerne rester av media og celleavfall, da cellene er kledde med en minimal mengde varme 0,05% Trypsin-EDTA. Trypsin er igjen på cellene for opp til fem minutter, da cellene er forsiktig forskyves med en 2ml serologisk pipette. Cellesuspensjonen samles og blandes med et stort volum av fargetoner media, blir deretter cellene samles ved forsiktig sentrifugering. Den inaktiverte trypsin media blanding fjernes, og cellene resuspendert i forvarmet fargetoner media. En passende Delingsforholdet beregnes (vanligvis 01:10-01:20), og celler re-belagt på en 1-2 dagers gammelplate som inneholder en monolayer av bestrålte mus embryonale fibroblast mater celler. Den nylig sådd Hues kultur plate er igjen urørt i 48 timer, så media blir endret hver dag etterpå. Det er viktig å ikke trpsinize ned til en enkelt celle suspensjon, da dette øker risikoen for å innføre karyotypic misdannelser.

Protocol

Generelt Vi anbefaler tining ikke mer enn én prøve på et gitt tidspunkt for å sikre enkel håndtering. Behandleren bør vokte seg for å forlate kulturer ved romtemperatur og lave CO2 i lange perioder av gangen. Alle sentrifugering av levende celler er gjort på 500-600 xg i 5 min ved romtemperatur. MEFs (Mus Embryonale Feeder Cells) Pre-varme MEF media til 37 ° C. Fjern MEF hetteglass fra -80 ° C og umiddelbart senk den nederste halvdelen av røre…

Discussion

I denne videoen viser vi hvordan vi rutinemessig passasje fargetoner humane embryonale stamcellelinjer i vårt laboratorium. Effektiv og regelmessig splitting og passaging er avgjørende for å opprettholde en sunn humane embryonale stamceller linje. Trypsin mediert passasje er en betydelig fordel av fargetoner cellelinjer, er det imidlertid viktig å ikke over trypsinize kulturer eller å ha en stor andel av enkeltceller under re-platting.

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 ml GlutaMAXTM 6.5 ml NEAA 6.5 ml 2‐mercaptoethanol 0.5ul KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 ml bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml